دانشگاه آزاداسلامي
واحد دامغان
عنوان پايان نامه:
جداسازي ، شناسايي مولکولي و بررسي خواص آنتي باکتريال پني سيليومهاي خاکهاي زراعي چند استان کشور
رشته :
بيماري شناسي گياهي
مقطع :
کارشناسي ارشد
استاد راهنما:
جناب آقاي دکتر محمد علي تاجيک قنبري
استاد مشاور:
جناب آقاي دکتر مهدي پيرنيا
ارائه توسط:
محمد علي جوادي
تير 91
تقديم به:
مادر گرامي؛
و روح پدر عزيز؛
و خانواده ام
و نيز محمد صفدري
و مهندس محمدرضا نجار نيارکي و احسان وفايي
با سپاس از:
جناب آقاي دکتر محمدعلي تاجيک قنبري، استاد راهنما که چراغ هدايت اينجانب در راه تحصيل از دوران کارشناسي تا کارشناسي ارشد بوده اند؛
نيز سپاس از آقاي دکتر مهدي پيرنيا استاد مشاور اينجانب؛
همچنين لازم است از آقايان مهندس علي ذهابي، محمد احمدي‌فر، مهدي راستبود، کيومرث روح رضي، محمد سياري، خليل و جليل بابايي و خانم‌هاي مهندس تلمادره‌اي، قاهري، دهبويد، تازيک، بخشي، سلطانتويه، شريعت پناهي، بقراط، آيرين جوادي تشکر و قدرداني نمايم.
چکيده:
گونه هاي قارچ پني سيليوم به واسطه توليد آنتي بيوتيک پني سيلين، مايکوتوکسين و آنزيم به ويژه پکتيناز و اسيد فوليک در مصارف بيوتکنولوژيک متعدد مانند پزشکي، کشاورزي و صنايع غذايي و موارد ديگر کاربردهاي گوناگوني دارد.
آنتي بيوتيک پني سيلين تا کنون جان ميليون ها انسان را نجات داد. قارچ پني سيليوم با تعداد قريب 200 گونه يکي از بزرگترين قارچ هاي خاکزاد و هوازاد است.
در اين تحقيق استخراج قارچ ها از خاک هاي مورد مطالعه از روش سوسپانسيون انجام شد. 1 ميلي ليتر از سوسپانسيون نهايي به پتري هاي حاوي آگار، رزبنگال و استرپتومايسين اضافه گرديد. پس از 7-5 روز کلني هاي پني سيليوم شناسايي و به لوله هاي حاوي PDA منتقل گرديد.
جدايه هاي باکتري ها روي محيط NA تهيه مايه تلقيح آنها با جدايه هاي پني سيليوم تلقيح شدند. شفافيت و کدورت نمونه ها با نمونه شاهد مورد مقايسه قرار گرفت.
يک قرص از توده ميسليومي از محيط کشت شفاف انتخاب و به محيط PDB جهت تهيه توده ميسليومي منتقل گرديد. توده ميسليومي در هاون حاوي ازت پودر گرديد، پودرها حاوي ويال‌هاي 5/1 ميلي ليتري گرديد 600 ميکرو ليتر بافر CTAB و 1 ميکروليتر مرکاپتانول اضافه گرديد. ويال ها وارد بن ماري شدند. با افزودن کلروفرم – ايزو آميل الکل سانتريفوژ انجام شده رسوب DNA با اتانول 70 ? شستشو داده بافر TE اضافه شد.
تعيين غلظت و خلوص نسبي به دو روش ژل آگارز 8/0? و نيز با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر انجام شد. DNA بدست آمده پس از ارزيابي جهت تکثير نواحي ريبوزومي مورد استفاه قرار گرفت. محصول PCR جدايه ها، جهت تعيين توالي به شرکت BIONEER کره ارسال گرديد.
شناسايي مولکولي جدايه ها در پايگاه اطلاعات NCBI با استفاده از Blast انجام وبر اساس توالي هاي معتبر موجود در بانک بر اساس بالاترين ميزان شباهت به دست آمده است.
در بررسي مولکولي بيش از 50 جدايه از 80 جدايه، منجر به شناسايي گونه هاي ذيل گرديد.
Penicillium aculeatum, P.aurantiogriseum, P.chrysogenum, P.citrinum,
P.commune, P.crustosum, P.griseofulvum, P.pinophilum, P.simplicissimum
در بررسي هاي قابليت هاي آنتي باکتريال جدايه ها، کليه جدايه ها در تقابل با شش گونه باکتري بيماري زاي گياهي به طور همزمان کشت داده شدند و بر اساس نتايج به دست آمده غالب جدايه ها فعاليت ضد باکتريايي داشته و از رشد باکتري ها ممانعت کردند.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول
مقدمه 6
فصل دوم: بررسي منابع
2-1-محيط خاک 9
2-2-بيواکولوژي Bioecology 9
2-3-بخش زنده خاک 9
2-4-رده بندي وال ورک (Wallwork) 12
2-5-ماکروارگانيسم هاي خاک 12
2-6- ميکروارگانيسم هاي خاک 13
2-7- شاخه نماتدها 14
2-8- فلور ميکروبي خاک 15
2-9- اکتينوميست هاي مهم و فراوان در خاک 18
2-10- جلبک ها (Algae) 18
2-11- تعامل ميکروارگانيسم هاي خاک با يکديگر 19
2-12- کنترل بيولوژيک 21
2-13- باکتري ها و خاک 25
2-14- ارزيابي فعاليت آنتي باکتريال پني سيليوم ها 26
2-15- پني سيليوم ها 28
2-16- فعاليت هاي بيولوژيک پني سيليوم ها 29
2-17- تنوع ژنتيکي 31
2-18- مطالعات مولکولي قارچها 34
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1-استخراج قارچ هاي خاک 41
3-2-جدايه هاي باکتريايي 42
3-3-ارزيابي توليد مواد بازدارنده رشد باکتريها 42
3-4- استخراج DNA 42
نتايج 48
نتايج شناسايي گونه ها 59
بحث 68
Abstract 78
منابع و مآخذ 79
فصل اول
مقدمه
مقدمه
مطالعات بيولوژي خاک شامل باکتري ها، جانوران، آغازيان و قارچ ها خاک است. از آنجا که بررسي‌هاي مربوط به فعاليت هاي بيولوژيک خاک ها و بويژه خاک هاي زراعي با شناسائي موجودات هر يک از زير مجموعه هاي زنده خاک شروع مي شود، تحقيقات مربوط به قارچ هاي خاک نيز نيازمند شناسائي فلور آنها است. جنبه هاي مختلف فعاليت قارچ هاي خاک در حاصلخيزي خاک هاي زراعي تأثير مستقيم و غير مستقيم داشته و غالب آنها در شرايط آزمايشگاهي قابل پيگيري مي‌باشند. از موارد قابل مطالعه در محيط آزمايشگاهي به توانائي جنس ها و گونه هاي مختلف ميکروميست ها در تجزيه مواد آلي بويژه سلولز و قابل استفاده ساختن عناصر غذائي ماکرو ميکرو و آزادسازي آنها از منابع نامحلول موجود در خاک براي گياه مي توان اشاره کرد. از قارچ ها مي توان جهت بهبود شرايط باروري خاک ها و رشد و نمو مناسب تر گياهان در خاک هاي نامناسب و کم بازده کمک گرفت. بخشي از فلور قارچي خاک به عوامل بيماريزاي پارازيت اختياري و پارازيت اجباري تعلق دارد.
قارچ ها يکي از اجزاء زنده محيط خاک هستند. هر ساله مقادير متنابهي از بقاياي گياهان زراعي به خاک هاي مزارع اضافه مي شوند که در نتيجه دخالت ميکروارگانيسم هاي خاکزي بويژه قارچ ها تجزيه شده و مواد آلي حاصل از آنها به خاک افزوده مي گردد.
قارچ هاي خاک به گروه هاي تاکسونوميکي متفاوتي تعلق دارند که فراوانترين آنها اووميکوتا، زيگوميکوتا دوتروميکوتا را مي توان نام برد. مطالعات مربوط به بيولوژي خاک در بخش قارچ ها با شناسائي تاکسونوميک آغاز و امکان پذير مي گردد.
سابقه شناسايي تاکسونوميک قارچهابه زمان آغاز نامگذاري دو اسمي موجودات زنده از زمان لينه برميگردد. از آن زمان تا به حال مطالعه مرفولوژيک قارچها تکامل زيادي يافته و با تکنيکهاي نوين بويژه روشهاي مولکولي تلفيق گرديده است . تاجايي که امروزه با معرفي و تکميل شناساگر هاي مولکولي و تعيين توالي قطعات مختلف ژنومي در حال تحول اساسي و کنار گذاشتن روشهاي مرفولوژيک است .
در اين تحقيق سعي شده تا يکي از فراوانترين قارچهاي خاکزاد مورد بررسي تاکسونوميک مولکولي قرارگرفته و از مجموع فعاليتهاي بي شمار آن ها در محيط خاک ، در شرايط آزمايشگاهي يکي از مهمترين آنها مورد مطالعه قرارگيرد.

فصل دوم

بررسي منابع

2-1 محيط خاک
خاک از مواد معدني، ريشه گياهان، موجودات زنده خرد و درشت، مواد آلي در مراحل مختلف تجزيه، آب و هوا تشکيل شده است.
پراکنش غير يکنواخت اين اجزا، شرايط بسيار متنوعي را در مقياس هاي مختلفي از حفره هاي کوچک تا سطح مزرعه ايجاد، و اين امر، مطالعه خاک را با مشکل رو به رو مي کند. طيف وسيعي از عوامل فيزيکي و شيميايي که داراي اثر متقابل هستند در تنوع خاک سهيم اند.
2-2 بيواکولوژي Bioecology
مطالعه و شناخت موجودات و همچنين رابطه اي که بين آن ها و محيط اطرافشان وجود دارد مي‌باشد. در اين علم مطالعه موجودات و ارتباط آن با محيطي که در آن بسر مي برند قرار مي گيرد.
1-2-2 بيو اکولوژي خاک
مطالعه موجودات زنده خاک، همچنين شرايط محيطي که اين موجودات در آن زندگي مي‌کنند و تعاملي که بين اين موجودات و شرايط محيطي موجود در زيستگاه آنها حاکم است مورد بررسي قرار مي گيرد.
2-3 بخش زنده خاک
موجودات زنده خاک به دو گروه تقسيم مي شوند
2-3-1 فلور که در لاتين (flora) ناميده مي شود شامل قارچ ها، باکتريها ، اکتينوميست ها ، جلبک ها ، ويروس ها ، و گياهان مي باشند.
2-3-2 فون که در لاتين به نام (Fauna) ناميده مي شود که به سه گروه بنام هاي ماکروفون، مزوفون و ميکروفون تقسيم شده است که شامل جانوران مي باشد.
2-3-3 بر اساس درشتي و ابعاد‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍،‍‍‍‍ موجودات زنده را به دو گروه ماکرو ارگانيسم و ميکروارگانيسم و ميکروارگانيسم ها را به 5 سلسله از لحاظ رده بندي يا تاکسونومي بنام هاي مونرا (Monera) يا پروکاريوت ها، پروتيست ها (Protista) يا موجودات تک سلولي (آغازيان)، حيوانات (Animalia)، قارچ ها (Fungi) و گياهان (Planta ) تقسيم کرده اند.
هر تغييري که در اکوسيستم خاک حادث شود ممکن است جمعيت موجودات زنده خاک اعم از فون و فلور را تحت تاثير قرار دهد و نيز موجودات زنده خاک موجب تغييرات فيزيکي و شيميايي خاک مي شود و به همين دليل در دراز مدت خواص شيميايي و فيزيکي خاک تحت تاثير موجودات زنده داخل خاک تغيير مي کند. اين تغيير در روي موجودات زنده داخل خاک اثر گذاشته و جمعيت آنها به تعادل ديناميک مي رسند.
2-3-4 انواع موجودات زنده خاک بر اساس اندازه
2-3-4-5 ماکرو ارگانيسم ها (Macro-organisms) با چشم غير مسلح قابل مشاهده هستند.
2-3-4-6 ميکروارگانيسم ها (Micro-organisms) با چشم ميکروسکوپ قابل مشاهده هستند.
2-3-4-6 افراد هر يک از دو گروه، بر حسب منشاء گياهي يا حيواني که دارند به دو دسته متمايز تفکيک مي شوند.
2-3-4-7 جانوران يا فون (Fauna)
2-3-4-8 گياهان يا فلورا (Flora)
2-3-4-9 جانوران ميکروسکوپي يا ميکروفون (Micro fauna)
2-3-4-10 گياهان ميکروسکوپي يا ميکروفلور (Micro flora)
2-3-4-11 جانوران ماکروسکوپي خاک
1-ميکروفون: اندازه بدن اين جانوران بطور متوسط کمتر از 2/0 ميلي متر است مانند پروتوزوئرها.
2-3-4-12 مزوفون (Mesofauna) يا ميوفون (Meiofauna): شامل جانوراني با اندازه متوسط 2/0 تا 4 ميلي متر است. مانند پادمان و کنه ها، بي شاخکان و دم چنگالان
2-3-4-13 ماکروفون (Macro fauna): شامل جانوراني با اندازه متوسط 4 تا 80 ميلي متر است مانند کرم خاکي و انواع حشرات بالدار و هزارپايان و عنکبوتيان و نرم تنان
2-3-4-14مگافون (Mega fauna): شامل انواع جانوران کاملا درشت به اندازه متوسط 80 ميلي متر تا 6/1 متر مانند بعضي خزندگان، بعضي موش ها و بعضي از خرچنگ ها .
2-4 رده بندي وال ورک (Wallwork): جانوران خاک را به سه گروه به اسامي ميکروفون (انواعي به اندازه 20 تا 200 ميکرون)، مزوفون (جانوراني به طول 200 ميکرون تا 1 سانتي متر) و ماکروفون (شامل انواعي به طول بيش از 1 سانتي متر) تقسيم کرده است[16].
2-5 ماکروارگانيسم هاي خاک
2-5-1 شاخه کرم هاي حلقوي يا آنيليدا (Phylum Annelida): از رده اليگوکتا (Oligochaeta) تحت نام کرمهاي خاکي و خانواده آنکي ترئيده (Enchytraeidae)
2-5-2 کرمهاي خاکي اکثراً از خانواده لومبريسيدها (Lumbericidea) و بعضي از آنها از خانواده مگاسکوليده (Megascolecidae)
2-5-3- کرمهاي حلقوي خانواده اَنکي تروييده (Enchytroieidae)
2-5-4- شاخه بندپايان (آرتروپدا) (Arthropeda)
اکثر بندپايان خاک، از سه رده عنکبوتيان، حشرات و هزارپايان و مقدار کمي جزو رده خرچنگ‌ها مي باشند.
2-5-6- رده عنکبوتيان (عنکبوت مانندها) يا اراکنيدا (Arachnida) شامل کنه ها
2-5-7- رده حشرات يا اينسکتا (Class insecta) شامل حشرات بدون بال يا بالدار مي‌باشند.
2-5-8- زير رده بي بالان يا آپتريگتا (Sub-class Apterygota) اکثراً از راسته پادمان هستند.
2-5-9- زير رده بالداران يا پتريگتا (Sub-class Pterygota) شامل سه راسته مساوي بالان يا (Isoptera).
2-5-10- راسته سخت بالپوشان يا کلئوپترا (Coleoptera) و راسته دو بالان يا ديپترا (Diptera)
2-5-11- رده هزارپايان يا ميرياپدا (Myriapoda) شامل راستة ديپلوپدا (Diplopeda) يا صدپايان مي باشد.
2-5-12- گروه دوم: مهره داران (Vertebrates): معدودي از جانوران مربوط به رده پستانداران (Mamalia)، خزندگان (Reptilia) و دوزيستان (Amphibia) خاکزي واقعي‌اند. از رده پستانداران راسته انسکتيورا (Insectivora) و راسته ردنتيا (Rodentia) را مي توان نام برد.
از رده خزندگان انواعي از لاک پشت ها، سوسمارها و مارها را مي توان بعنوان خاکزي معرفي کرد. از رده دوزيستان، فقط قورباغه گونه آپدا (Apoda) از خانواده سسيليده (Caecilidae) را مي توان نام برد.
گروه سوم، گياهان: در بين گياهان فقط بعضي از انواع بدون گل اندام هاي اصلي آنها تماس کامل با زمين دارند بعنوان موجودات خاکزي بحساب مي آيند. شامل هپاتيک‌ها، خزه ها و گلسنگ‌ها و خزه مي باشند[3].
2-6- ميکروارگانيسم هاي خاک: جانوران ميکروسکوپي خاک
2-6-1- ساخه پروتوزوئرها (Phylum Protozoa)
موجودات تک ياخته، ساده ترين و در فن فراوانترين گروه جانوران خاک را تشکيل مي‌دهند. شامل چهار زير شاخه تفکيک شده است که دو زير شاخه اسپروزوئا (Sporozoa) و کنيدوسپورا (Conidospora) خاکزي نيستند و پروتوزوئرهاي مهم خاکزي مربوط به دو بالا رده سارکودينا (Sarcodina) و ماستيگوفورا (Mastigophora) مي باشند.
2-6-2- بالا رده سارکودينا شامل سه رده است که انواع خاکزي در رده ريزوپدئا (Rhizopodea) در آن قرار مي گيرند.
راسته آميب ها (Amoebida) در اين رده قرار مي گيرند.
2-6-3- بالا رده ماستيگوفورا شامل رده فيتومستيگوفورا (Phytomastigophorea) فتوسنتز کننده اند رده زومستيگوفورا (Zoomastigophorea) زندگي هتروتروفي دارند.
رده سلياتئا (Cilliatea) داراي مژه و دو تيپ هسته در بدن خود مي باشند[3].
2-7- شاخه نماتدها
نماتدها به سلسله جانوران تعلق دارند گاهي (eelworm) خوانده شده، در ظاهر کروي شکل هستند ولي از نظر رده بندي موجودات زنده با کرمهاي حقيقي تفاوت دارند[13].
اندازه بدن نماتدها 300 تا 1000 ميکرومتر و حداکثر 4 ميلي متر طول و 15 تا 35 ميکرومتر قطر يا عرض دارند. بدن نماتدها کم و بيش شفاف است و با غشاء کوتيکولي بيرنگ که معمولاً داراي خطوط موازي يا با علائم ديگر پوشيده شده است.

2-8- فلور ميکروبي خاک
2-8-1- پروکاريوت ها (Procaryotes)
پروکاريوت ها عموماً ميکروارگانيسم هاي تک سلولي هستند که داراي يک غشاء سلولي يا يک غشاء و يک ديواره سلولي هستند که سيتوپلاسم را احاطه کرده و سيتوپلاسم آن ها حاوي ريبوزوم‌هاي کوچک (s70) و مواد ژنتيکي (دي. ان. اي) است که غشايي آن را در بر نگرفته و همانند يک هسته سازمان يافته نيست.
پروکاريوت ها شامل باکترها (Bacteria) که داراي يک غشاء سلولي و يک ديواره سلولي و موليکوت ها (Mollicutes) يا موجودات شبه مايکوپلاسمايي (MLO) که فاقد ديواره سلولي هستند مي باشند[41].
2-8-2- باکتري ها
– مشخصات عمومي باکتري ها
داراي انواع گرد (Cocci)، ميله اي (Bacilles)، خميده (Vibrions) و مارپيچي (Sprilles) ديده مي شوند. اندازه باکتري ها از 1/0 ميکرون تا 15 الي 20 ميکرون متغير است. بعضي از باکتري هاي گوگردي ممکن است اندازه بدن به 1 ميلي متر هم برسد. قطر باکتري ها 5/0 تا 1 ميکرون و در انواع باسيلي تا 5/1 ميکرون هم مي رسد.
سلول باکتري شامل سيتوپلاسم، مواد هسته و ديواره هاي پوششي است. مواد هسته داخل سيتوپلاسم پراکنده اند. سيتوپلاسم توسط غشاء سيتوپلاسمي بين ديواره سلولي (Cellwall) احاطه مي شود.
بعلاوه معمولاً ورقه نازک نرمي (Slime layer) از مواد هيدروکربنه و يا مواد موکرپروتئين همراه با مواد پلي ساکاريدي بنام کپسول سلول باکتري را مي پوشاند. بعضي باکتري ها جهت مقابله با شرايط نامساعد محيطي تشکيل اسپر مي دهند. حرکت توسط تاژک ها انجام مي شود.
2-8-3- باکتري هاي مهم و فراوان خاک
باکتري هاي خاک از صدها گونه بسيار متفاوت تشکيل مي شوند. رده بندي بر اساس شکل سلول ها و طرز قرار گرفتن آن ها نسبت به هم، وجود تاژک، تعداد و طرز قرار گرفتن آن ها روي سلول، دارا بودن اسپر، اندازه و محل تشکيل آن در ياخته، احتياج به اکسيژن ملکولي، منبع کسب انرژي، مواد کربن دار و احتياج به ويتامين و فاکتورهاي رشد و توانايي استفاده از ازت آزاد اتمسفر و غيره در حال حاضر براي مطالعه تشخيص باکتري ها خاک بيشتر از رده‌بندي کلي استفاده مي‌شود.
جنس هايي از باکتري ها در خاک فراوانند[1].
2-8-12- آرتروباکترها (Arthrobacters) يا گونه هاي جنس Arthrobacter بيشترين تعداد باکتري هاي خاک را تشکيل مي دهند، چند شکلي و گرم متغيرند.
2-8-13- استرپتومايست ها (Streptomycetes) شامل سه جنس استرپتومايسيس، سودوموناس (Pseudomonas) و باسيلوس (Bacillus) پس از آرتروباکترها از نظر مقدار مقام دوم را بخود اختصاص مي دهند.
2-8-14- سودومونادها (Pseudomonads)
اعضاي جنس سودوموناس، ميله اي راست يا خميده و گرم منفي با تاژک قطبي مي باشند.
2-8-15- باسيليوس هاي اسپورز (Sporulating Bacilli)
اعضاي‌جنس باسيلوس،باکتري‌هاي‌ميله‌اي‌مثبت‌تا گرم‌منفي‌متغيرند. بيشتر گونه‌ها متحرک‌مي‌باشند.
2-8-16- سيانوباکتري ها (Cyanobacteria): گرم منفي و فتواتوتروف اند.
2-8-17- اکتينوميست ها (Actinomycetes)
اکتينوميست ها داراي سلول هاي باريک و بلند با انشعابات کم و بيش فراوان شبيه ميسليوم قارچ ها مي باشند. رشته هاي ميسليوم فاقد ديواره عرضي بوده قطر آن ها 5/0 تا 5/1 ميکرون مي‌باشد. ميسليوم هاي رويشي (Vegetative mycelium) معمولاً روي سطح مواد غذايي پراکنده مي شوند و در بعضي انواع روي آنها رشته هايي بنام ميسليوم هوايي (Aerial mycelium) بطور عمودي بوجود مي آيند، ميسليوم ها گاهي سفيد بيرنگ ولي تعداد زيادي قادر به توليد دانه هاي رنگي مي باشند. اين موجودات اکثراً بدون حرکت هستند و زادآوري بصورت غير جنسي است که با توليد اسپرهاي مختلف و يا با تقسيم ميسليوم انجام مي شود[1].
از نظر رده بندي کلي، اکتينوميست ها را بدليل شباهت بيشتري که با باکتري ها، بخصوص از نظر ساختمان سلولي دارند، در راسته اکتينوميستال از شاخة باکتري ها قرار داده اند.
اين راسته طبق رده بندي جديد در 8 خانواده به نام اکيتنوميستاسه (Acthinomycetacae) ميکوباکترياسه (Mycobacteriaceae)، فرانکياسه (Frankiaceae)، اکيتنوپلاناسه (Actinoplanaceae)، درماتوفيلاسه (Dermatophilaceae)، نوکاردياسه (Nocardiceae)، استرپتوميستاسه‌(Streptomycetaceae)‌و ميکرومونوسپراسه‌(Micromonosporaceae)‌است.
2-9- اکتينوميست هاي مهم و فراوان در خاک
اکتينوميست هاي مربوط به دو خانواده درماتوفيلاسه و اکيتنوميستاسه حالت پارازيتي دارند و در خاک فعاليتي ندارند.
خانواده فرانکياسه فقط داراي جنس فرانکيا (Frankia) که گونه هاي آن به حالت همزيستي در غده ريشه گياهان غير لگومينوز مثل توسکا بسر مي برند[1].
خانواده ميکوباکترياسه فقط شامل جنس ميکوباکتريوم است و تعداد نسبي گونه هاي آن در خاک زياد نيست.
در راسته اکتينوميستال چهار خانواده زير اهميت نسبي بيشتري در خاک دارند:
1- خانواده نوکاردياسه 2- خانواده استرپتوميستاسه 3- ميکرونوموراسپراسه 4- خانواده اکتينوپلاناسه
2-10- جلبک ها (Algae)
جلبک ها ساده ترين يوکاريوت هاي کلروفيل دار هستند که بوسيله خصوصيات جنسي از گياهان سبز متمايز مي شوند. در جلبک هاي تک ياخته اي ممکن است يک ارگانيسم کامل بعنوان يک گامت (ياخته تکثير جنسي) عمل کند و در جلبک هاي پر ياخته اي، گامت هاي تک ياخته اي يا پر ياخته اي بوجود مي آيند، در تکثير غير جنسي، جلبک ها توليد اسپورهاي تاژکدار و يا غير متحرک مي کنند.
در انواع خاکزي در سطح يا داخل خاک، روي سنگ ها، لجن، شن و بر روي زمين ها و ساختمان ها و چسبيده به گياهان (ساقه، تنه و برگها) وجود دارند[3, 11].
اکثر جلبک هايي که در زير خاک يافت مي شوند به فرم خواب بوده اما برخي ديگر بعنوان ارگانوتروف اختياري شناخته مي شوند.
در طبقه بندي جديد جلبک ها تاکيد بيشتر بر روي رنگدانه، اجزا و ديواره ياخته، ساختمان ياخته، مواد ذخيرهاي و داشتن تاژک مي باشد و شامل ده زير شاخه عمده مي باشد.
فراواني آنها نسبت به ساير ميکروفلور خاک کمتر بوده ولي داراي دامنه وسيع انتشار مي‌باشند. جلبک ها تا عمق 15 سانتي متر و گاهي تا عمق 2 متر هم پيدا مي شوند. در خاکهاي زراعي و مرطوب بيشتر از خاکهاي سبک و غير حاصلخيز وجود دارند.
2-11- تعامل ميکروارگانيسم هاي خاک با يکديگر
اثرات متقابل بسيار زيادي (در سطح موجود زنده و جمعيت) در بين موجودات زنده ي مختلف خاک وجود دارد. بسياري از اين اثرات متقابل، زودگذر و پراکنده بوده، و بعضي ديگر پايدارتر هستند. در جدول (1) انواع اثرات متقابل بين موجودات زنده در خاک مشاهده مي شود که از همکاري متقابل1 (دو موجود زنده سود مي برند) تا بي تأثير2 (هيچ نوع سودي نصيب هر يک از موجودات زنده نمي شود) را در بر مي گيرد.
اصطلاح همزيستي3 مربوط به هر گونه رابطه اي بين دو موجود زنده يا دو جمعيت مي شود که در غياب تغييرات محيطي به صورت پايدار است. البته در بيشتر مواقع، اين اصطلاح براي توصيف روابطي که براي هر دو موجود زنده سودمند باشد به کار برده مي شود، و واژه مربوط در اين مورد، همکاري دو جانبه يا همزيستي دو جانبه است.4
جدول ( 1)- انواع مختلف اثرات متقابل بيولوژيکي موجود در خاک
اثر متقابلتعريفهم زيستيرابطه ي بين دو موجود زنده يا در جمعيت که در غياب تغييرات محيطي پايدار است. (1) همکاري‌متقابل‌يا دو‌جانبه هر دو موجود زنده سود مي برند. (2) هم ياري5 هر دو موجود زنده سود مي‌برند اما اين همکاري براي ادامه حيات آنها ضروري نيست. (3) بي تاثيريهيچ يک از دو موجود زنده سود نمي برند. (4) سودبري يک جانبه6يک موجود زنده سود مي برد در حاليکه ديگري تحت تاثير قرار نمي گيرد. (5) تعارض7يکي از موجودات زنده يا هر دو زيان مي بينند. (a) رقابت8دو گونه بدليل ترشح سم بوسيله گونه ديگر، از فعاليت منع مي شوند. (b) زيان يک جانبه9دو گونه بدليل ترشح سم به وسيلة گونه ديگر از فعاليت منع مي شود. (c) طعمه جويي 10يک موجود زنده به وسيله ديگري بلعيده مي شود. (d) انگلي11يک موجود زنده مواد غذايي مورد نياز خود را از بافت زنده موجود ديگر بدست مي‌آورد. (u) تشديد12رابطه‌اي که فعاليت مرکب دو موجود زنده، بيش از فعاليت هر يک از آنها مي‌شود. 2-12- کنترل بيولوژيک
مبارزه بيولوژيک با عوامل بيماريزايي گياهان بويژه پاتوژن هاي خاکزاد که بيشترين و بالاترين خسارت اقتصادي را به محصولات کشاورزي دنيا وارد مي سازند، از جمله عملياتي است که اصول آن بطور ناآگاهانه قرنها با رعايت تناوب زراعي بکار گرفته ميشده است. از زمان هاي نخستين، بشر سعي بر آن داشت که توليد محصول خود را از طريق غني نمودن خاک و يا تغييرات در عمليات زراعي افزايش داده تا از اين رهگذر شاهد کاهش خسارت بيماريهاي گياهان و مآلاً افزايش توليد باشد.
بيکر[5] در اين باره مي نويسد که واژه آنتاگونيسم در ميکروب شناسي اولين بار توسط Roberts (1874) با نشان دادن فعاليت هاي آنتاگونيستي ميکروارگانيسم ها در محيط کشت مايع (liquid culture) و بين قارچ Penicillium glaucum و باکتريها به دنياي علم معرفي گرديد و بدنبال آن، دنيا شاهد کشف بزرگ آنتي بيوتيک پني سيلين توسط فلمينگ بود. در حاليکه اولين کوششها در کاربرد مستقيم مبارزه بيولوژيک عليه پاتوژن هاي گياهان توسط Hartley (1921) و با کنترل قارچ Pythium debaryanum با 13 قارچ آنتاگونيست انجام گرفت. اما همانگونه که در سمپوزيوم اکولوژي پاتوژنهاي خاکزاد گياهان پيش درآمدي در کنترل بيولوژيکي در سال 1963 در دانشگاه کاليفرنيا و برکلي اشاره نمودند، اولين آزمايش ها در زمينه مبارزه بيولوژيک با بيماريهاي گياهان بوسيله آنتاگونيست هاي باکتريايي در کانادا توسط Sanford (1926) انجام گرفت. سپس Sanford and Broadfoot (1931) مقاله اي در خصوص مبارزه بيولوژيک با بيماري پاخوره گندم (Take-all disease) به چاپ رسانيدند و در آن اثر بازدارندگي دو قارچ، 15 باکتري و يک اکتينوميست را روي عامل بيماري پاخوره در گلدان هاي حاوي استريل و آلوده شده به اين عوامل به نمايش گذاشتند. از اين تاريخ به بعد واژه مبارزه بيولوژيک در مبحث بيماري هاي گياهان مطرح گرديد. پس از يک وقفه طولاني در سال 1965 ميلادي مطالعات روي اين پديده ابعاد وسيعتري به خود گرفت و مبارزه با بسياري از بيماري ها با استفاده از پارازيت ها، شکاري ها، قارچ هاي شکارگر نماتدها (Trapping fungi of nematods)، آميبهاي بزرگ (Giant amobae) باکتريها، ويروس ها، ريکتيساها، پرتوزئواها، نماتدها، حشرات و غيره انجام گرديد.
تعاريف مبارزه بيولوژيک:
1- Garrett (1965) در تعريف جامع مبارزه بيولوژيک مي آورد بيوکنترل يعني تحت هر شرايطي و هر عملي، بقاء يا فعاليت پاتوژني در رابطه هر عامل زنده ديگر (با استنثاء انسان) کاهش يابد و لاجرم به کاهش خسارت بيماري بيانجامد.
2- Garrett (1970) در تکميل تعريف قبلي خود مي نويسد بيوکنترل عمل يا عرصه اي است که به موجب آن اثرات نامطلوب ارگانيسمي بواسطه فعاليت ارگانيسم ديگري که در زمره گياه ميزبان، آفت يا پاتوژن يا انسان نباشد کاهش يابد.
Baker and Cook (1974) در مبارزه بيولوژيک مي نويسند:
مايه يا فعاليت هاي بيماريزايي يک پاتوژن يا يک پارازيت که در حال فعاليت يا سکون است، توسط يک يا چند ارگانيسم که بصورت طبيعي و يا از طريق دستکاري محيط، ميزبان يا انتاگونيست کاهش يابد.
بالاخره توصيف جديدي Baker (1987) ارائه گرديده است به اين مفهوم که:
کنترل بيولوژيکي عبارتست از کاهش مايه يا فعاليت ايجاد بيماري (بيماريزايي) يک پاتوژن توسط يک يا چند ارگانيسم حتي گياه ميزبان و نه انسان.
امروز، جهت مبارزه بيولوژيک موارد مختلفي مد نظر است که 5 مورد عمده آن عبارتند از:
1- کاستن دانسيته يا غلظت مايه عامل بيماري قبل از اينکه ميزبان کشت گردد.
2- جايگزين کردن پاتوژن هاي مستقر در بقاياي گياهي يا ساپروفيست ها قبل از کشت ميزبان.
3- ممانعت از تکثير رشد يا دخالت عامل بيماري از طريق مکانيسم هايي چون رقابت (Competion) آنتي بيوز (antibiosis) پارازيتيسم، يا شکار (Parasitism/predation) و غيره در قبل يا بعد از کشت ميزبان.
4- حفظ منطقه اي که احتمال آلودگي آن مي رود (infection court) بطريقه اشغال و مستقر کردن آن مناطق يا غير پاتوژن ها و يا پاتوژن هاي ضعيف بعد از کشت ميزبان.
5- تحريک ايجاد مقاومت در ميزبان (induced resistance) از طريق آلوده کردن آن با سويه يا نژاد غير بيماريزا يا ضعيف پاتوژن.
مکانيسم هاي عمومي آنتاگونيسم ميکروبي
1- رقابت (Competition)
تلقي کلي از مفهوم رقابت وجود يک سيستم سه گانه اي است که در آن پاتوژن و آنتاگونيست در محل رقابت (ريشه گياه) با هم اثر متقابل دارند و لذا در مکانيسم رقابت، پاتوژن و آنتاگونيست رقيب يکديگر در استفاده از مواد غذايي مترشحه ريشه يا بذر، محل (niche) يا عرصه آلودگي (infection site) و اکسيژن (تاثير گازهاي ديگر هنوز بطور معني دار مشخص نيست) مي باشند. اين مکانيسم اکثراً بصورت تقابل هاي بين باکتري ها و پاتوژن ها روي ريشه ظاهر مي شود.
مثال کنترل بيولوژيکي P.ultinum توسط باکتري از طريق رقابت براي استفاده از کربن و نيتروژن و نيز رقابت نماتدهاي پارازيت داخلي با باکتري مولد غده در محل ريشه بقولات نظير نماتد H.glycines با باکتري Rhizobium japonicum و M.lavanica با باکتري R.trifolii که منجر به عدم تشکيل غده در ريشه گياهان مي شود.
2-در پارازيتيسم با شکار (Parasitism/Predation)
پارازيتيسم رابطة غذايي است که ارگانيسم (پارازيت) تمام مايحتاج غذايي خود را از قسمت‌هاي زنده و فعال ارگانيسم ديگري (ميزبان) تامين مي نمايد.
مثل انواع قارچهاي تله اي نماتدها و قارچ هاي پارازيت داخلي که باعث کنترل نماتد سيست مي شود. يا باکتري Pasteuria penetrans پارازيت نماتد مولد گال مي باشد.

3- آنتي بيوز (antibiosis)
آنتي بيوز مکانيسمي است که با توليد متابوليت هايي چون آنتي بيوتيک ها توسط ميکروارگانيسم هاي خاک عليه ديگر ميکروارگانيسم ها پديد مي آيد.
4- تغيير (modification) در مقاومت ميزبان
در اين مکانيسم مطرح شده توسط vidaver (1982) دو فرضيه مهم بيولوژيکي يعني تحريک مقاومت تحريکي و مقاومت ايجادي در ميزبان قابل بررسي است شامل دو جنبه است:
a- مقاومت تحريکي يا واداري (Induced resistancy)
براي پديد آوردن مقاومت تحريکي در ميزبان در برابر پاتوژن سازگار ابتدا گياه را با پاتوژن غير سازگار آلوده کرده و منتظر واکنش دفاعي مي شوند. در چنين حالتي که گياه مقام دفاعي به خود گرفته پاتوژن سازگار نيز قادر به ايجاد بيماري نمي گردد بدين طريق مقاومت تحريکي در ميزبان صورت محقق بخود مي گيرد.
b- مقاومت ايجادي (Cross protection)
با استفاده از سويه هاي ويروس غير بيماريزا (avirulent ormild) مي توان گياه را از طريق تحريک سيستم دفاعي ناشي از مقاومت ايجادي عليه ويروس دوم که بيماريزا مي باشد مقاوم کرد.
2-13- باکتري ها و خاک
باکتري ها موجودات تک سلولي هستند و حجم و دانسيته بسيار زيادي از فلور خاک را شامل مي شوند، جمعيت 100 ميليون تا 3 ميليون در يک گرم خاک.
باکتري ها با سرعت زياد تکثير مي شوند طوريکه يک باکتري در عرض 24 ساعت تعداد 16 ميليون باکتري توليد مي کند. باکتري معمولاً در نزديکي ريشه زندگي مي کنند و بيشتر رايزو باکترها را شامل مي شود.
اکثر باکتريهاي مفيد خاک جهت ادامه بقا نيازمند به اکسيژن هستند که باکتري هاي هوازي ناميده مي شوند در حاليکه بعضي از باکتريها جهت ادامه بقا نيازمند به اکسيژن نمي باشند که از بقاياي موجودات مرده خاک استفاده مي کنند. که اين باکتري ها را غير هوازي مي‌ناميم. باکتري هاي هوازي اغلب در خاکهاي مرطوب و pH خنثي فعال هستند.
مهمترين نقش باکتري ها در خاک شامل:
نيتريفيکاسيون، تثبيت نيتروژن، دنيتريفکاسيون و چندين گونه از باکتري ها از جمله جنس تيوباسيلوس Thiobacilus با عمل اکسيداسيون موجب کاهش ترکيبات گوگرد مي شوند.
باکتري Thiobacillas thioxidans اکسيد کننده گوگرد از اسيد سولفوريک است.
2-13-1- باکتريهاي مفيد خاک (باکتري هاي PGPR)
2-14- ارزيابي فعاليت آنتي باکتريال پني سيليوم ها
بخشي از فعاليت بيولوژيک خاک ها نتيجه فعاليت قارچهاي خاکزي است. قارچهاي خاک شامل گروه‌هاي مختلف و متعلق به دستجات تاکسونوميک متفاوتند[30] از اين بين در جنس پني سيليوم و آسپرژيلوس جزو فراوانترين اعضاي فلور قارچي خاکهاي مناطق مختلف‌اند و تقريباً در همه خاکهاي مناطق خشک و مرطوب يافت مي‌شوند. در مقوله بيولوژي خاک ارزيابي فعاليت بيولوژيک خاک بصورت عام و براي تمامي موجودات زنده ساکن آن خاک انجام مي‌شود. از اين رو تفکيک و تعميم نتايج بدست آمده براي گروههاي اختصاصي مثل قارچها و باکتريها يا اکتينوميست‌ها امکانپذير نيست تا سهم هرکدام در مجموعه فرايند بيولوژيک سنجش شده معلوم گردد.
براي نيل به اين هدف جداسازي، شناسايي و مطالعه اختصاصي قابليت هاي بيولوژيک گروههاي مختلف ميکروارگانيسم ها ضروري به نظر مي رسد. (Tajick Ghanbaryet al. 2009).
در عمده منابع بيوشيمي خاک فعاليت هاي آنزيمي خاک مورد بررسي و مطالعه قرار گرفته است که به عنوان شاخص هايي براي سنجش فعاليت بيولوژيک خاکهاي مورد مطالعه از آنها استفاده مي شود. (P.Nannipievi, 1995 Kossem, A. and).
احتمالاً تمامي ميکروارگانيسم هايي که داراي فعاليت آنزيمي مورد مطالعه هستند در نتايج بدست آمده سهيم اند. ارزيابي اختصاصي متابوليت هاي ثانويه و جداسازي خالص‌سازي آنها از خاک با توجه به شرايط بيولوژيکي و فيزيکي خاکها کاري بس دشوار است. از اين رو فرايند بررسي درون شيشه اي توليد ميکروارگانيسم هاي مولد، فرايند ساده و قابل اعتمادتري بنظر مي رسد. از بين دستجات مختلف متابوليت هاي ثانويه آنتي بيوتيک ها به عنوان مواد بازدارنده رشد ساير ميکروارگانيسم ها مورد توجه ويژه بيولوژيست ها بوده‌اند.
قارچ ها يکي از توليدکنندگان اصلي مواد آنتي بيوتيکي هستند که در محيط هاي مختلف بويژه خاک قادر به توليد و اعمال تأثير بر ساير ميکروارگانيسم ها هستند [2]متابوليت هاي ثانويه مترشحه از پني سيليومها خواص بازدارنده رشد باکتري هاي گرم مثبت و گرم منفي مي باشد.
2-15- پني سيليوم ها
قارچها به همراه باکتري ها، پروتيستا و گياهان نقش اصلي را در اکوسيستم خاک دارند. قارچهاي خاکزي بيشتر به عنوان ساپروفيت و موجودات تجزيه کننده به حساب مي آيند. بعضي از گونه مايکوريزاها نيز پاتوژن گياهان هستند[37].
پني سيليوم يکي از بزرگترين صور غير جنسي قارچ هاي اسکوميست مي باشد. همچنين داراي پراکنش وسيعي در خاک مي باشد. پني سيليوم داراي 200 گونه مي باشد که از اين بين تعداد زيادي خاکزي اند. پني سيليوم مربوط به شاخه Deutromycota مي باشد. متابوليت‌هاي ثانويه پني سيليوم شامل مواد آنتي باکتريال، مواد ضد قارچي و مايکوتوکسين ‌ها مي‌باشد. متابوليت هاي زيستي فراواني از اين قارچ بدست آمده است[37].
پني سيليوم يک منبع توليد پني سيلين است که خود نوعي آنتي بيوتيک است[45].
گونه ها بر اساس رنگ اسپور بعنوان کپک سبز شناخته مي شوند. از نظر ريخت شناسي بر پايه ساختار کنيدي و کنيديوفور و اندازه گيري و رنگ کلني در شرايط استاندارد مي باشد[10].
اين پني سيليوم شامل 4 زير جنس ذيل است:
Biverticillium، Penicillium، Aspegilloides و Furcatum
اساس اين تقسيم بندي بر تعداد نقاط انشعاب بين فياليد و ساقه تعيين مي شود. و اگر انشعابات شبيه بهم باشد شناسايي بر اساس طول متولا به فياليد و طول و قطر کلني در محيط کشت مي‌باشد[10].
گونه هاي ساپروفيت معمولاً خاکزي اند که باعث تخريب سبزيجات، بذر و دانه ها مي‌شوند. پني سيليوم بيشتر در مناطق سرد و خنک ديده مي شود ]38[. تعداد زيادي گونه از جنس پني سيليوم باعث پوسيدگي انباري بويژه روي مرکبات مي شود که به عنوان کپک آبي و مرطوب شناخته مي شود[35].
P.italicum و P.digitatum عامل پوسيدگي ميوه مرکبات است. P.expansum و P.discolor عامل پوسيدگي مغز خشکبار است. P.brevicompactum عامل پوسيدگي زنجبيل و P.sclerotigenum عامل پوسيدگي سيب زميني شيرين است[35].
2-16- فعاليت هاي بيولوژيک پني سيليوم ها
پني سيليوم مولد آنزيم هاي تجزيه کننده نشاسته، پروتيين، زايلان و ليپيد است. پني سيليوم توليد کننده آنزيم هاي خارج سلولي به حساب مي آيند. مطالعه توکسين هاي توليد شده در اثر پني سيليوم هم در کشاورزي و هم در صنايع غذايي مهم است.[45]. بکارگيري آنزيم هاي ميکروبي نقش و کاربرد وسيعي در صنايع مختلف دارد.
پکتينازها از متابوليت‌هاي ثانويه و آنزيم‌هاي خارج سلولي توليد شده توسط پني‌سيليوم مي‌باشد.
آنزيم پکتيناز بعنوان آنزيم هيدروليز کننده شامل پلي گالاکتورونازها، پکتين، پکتين ليازها، پکتات ليازها و استرازها مي باشد.
پکتينازها بر اساس مکان برش درون يا انتهاي سوبسترا، آنها به دو گروه اند و اگزو تقسيم مي‌شوند. در مورد پني سيليوم هاي بيماري زا در گياهان، بيماريزايي در بافت هاي گياهي بوسيله آنزيم هاي پکتيک شروع مي شود [25].
پلي گالاکتورونازها به عنوان عامل بيماري زايي باعث از بين رفتن ديواره سلولي گياه مي‌شود[19].
پني سيليوم بعنوان منبع قارچي توليدکننده آنزيم پکتيناز مي باشد. (Pericin et al., 2007).
پني سيليوم چون فاقد ساختار نفوذ آلوده کنندگي اختصاصي است داراي آنزيم تجزيه کننده ديواره سلولي مي باشد. (Howell& Davis, 2005). ديواره سلولي گياه شامل ماتريکسي از ميکروفيبرل هاي سلولزي پيوند يافته با همي سلولز و پکتين مي باشد. (Celestiono et al., 2000). پلي ساکاريد ديواره سلولي شامل سلولز، همي سلولز و پکتين مي باشد. تمامي گروه هاي اصلي قارچ هاي بيماريزا نيازمند آنزيم هاي خارج سلولي است که بتواند پليمرهاي ديواره سلولي گياه را تجزيه کند. (Batman & Bashom, 1976).
در عمده منابع بيوشيمي و بيولوژي خاک فعاليتهاي آنزيمي خاک مورد بررسي و مطالعه قرار گرفته است که به عنوان شاخص‌هايي براي سنجش فعاليت بيولوژيک خاکهاي مورد مطالعه از آنها استفاده مي‌شودP. Nannipieri, 1995) Kossem, A. and). احتمالا تمامي يکروارگانيسم‌هايي که داراي فعاليت آنزيمي مورد مطالعه هستند در نتايج بدست آمده سهيم اند . ارزيابي اختصاصي متابوليت هاي ثانويه وجداسازي و خالص سازي آنها از خاک با توجه به شرايط بيولوژيکي و فيزيکي خاکها کاري بس دشوار است . از اين رو بررسي درون شيشه اي توليد متابوليتهاي ثانويه با استفاده از کشت خالص ميکروارگانيسم هاي مولد ، فرايند ساده و قابل اعتمادتري به نظر مي رسد . از بين دستجات مختلف متابوليت هاي ثانويه آنتي بيو تيکها به عنوان مواد بازدارنده رشد ساير ميکروارگانيسم ها مورد توجه ويژه بيولوژيست ها بوده اند. قارچها يکي از توليد کنندگان اصلي مواد آنتي بيوتيکي هستند که در محيط هاي مختلف بويژه خاک قادر به توليد و اعمال تاثير بر ساير ميکروارگانيسم ها هستند[2]. در اين تحقيق سعي گرديده است قابليت توليد مواد آنتي باکتريال و ممانعت از رشد تعدادي باکتري گرم مثبت و گرم منفي توسط جدايه هاي مختلف قارچ پني سيليوم که از خاکهاي زراعي مناطق مختلف ايران جدا گرديده اند ، در شرايط درون شيشه اي مورد مطالعه و بررسي قرار گيرد.
2-17- تنوع ژنتيکي
در ابتدايي ترين سطح، تنوع به معناي وجود و تأييد تفاوتها است و تنوع ژني به معناي وجود تفاوت در ژن هاي مختلف تمام گونه هاي زنده از قبيل گياهان، حيوانات، قارچ ها و موجودات ذره بيني مي



قیمت: تومان


پاسخ دهید