بسم الله الرحمن الرحيم
دانشکده علوم دامي و شيلات
پاياننامه کارشناسي ارشد رشته‌ي علوم دامي گرايش اصلاح نژاد دام
شناسايي چند شکلي‌هاي‌آللي جايگاه‌هاي ژني HSP70.1 و HSP90AB1 و ارتباط آن‌ها با صفات توليد شير در گاو هلشتاين
استاد راهنما:
پروفسور قدرت الله رحيمي ميانجي
استاد مشاور:
دکتر ايوب فرهادي
دانشجو:
عاطفه يعقوبي کياسري
اسفند 1393
کليه حقوق مادي مترتب بر نتايج مطالعات، ابتکارات
و نوآوري‌هاي ناشي از تحقيق موضوع اين پاياننامه
متعلق به دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبيعي ساري است.
تقدير و تشکر:
سپاس از خداي مهربانم
قدر استاد نکو دانستن/ حيف که استاد به من ياد نداد…
سپاس از استاد بزرگوارم جناب پرفسور رحيمي براي تمام لحظات بودنش جهت پيشبرد بهتر مشق ارشدم، خدايا تو خود داني خود نيز نگهدارشان باش. سپاس از استاد هميشه همراهم جناب دکتر فرهادي که هميشه پاسخگوي سوالات و مشکلات گاه و بي گاهم بود، خدايا هميشه همراهشان باش و هيچگاه بي جوابشان مگذار. سپاس از استادان گرانقدرم جناب دکتر حافظيان، دکتر قلي زاده و دکتر فيروزبخش براي قبول زحمت داوري و مديريت، خدايا در داوري زندگيشان خوبي ها را برايشان تدبير کن.
سپاس از آقاي مهندس روحي، مهندس گودرزي و دکتر صفدريان جهت همکاري و راهنمايهايشان در آزمايشگاه، خدايا در آزمايش الاهيت سربلندشان دار. سپاس از عوامل محترم گاوداري مهدشت (آقايان رضايي، مولايي و دکتر ديرنده)، هم کلاسي ها و دوستان خوبم )خانم کرمي نژاد، خانم قاضي، خانم محمدي کشکا، آقاي پسنديده و بخصوص خانم بابامحمدي و همسرشان جناب نجفي( که هميشه کنارم بودند، بودنتان زيبا در پناه خدا.
سپاس از خانواده خوبم، بخصوص پدر مهربانم و برادران هميشه همراهم که بودنشان مايه دلگرمي و سربلندي من است، خدايا سلامتشان دار.
و و در آخر ممنونم از مادر عزيزم که در نبودش، دعاي خيرش هميشه همراهم بود، روحت شاد بهترينم.
تقديم اثر:
تقديم به پدر مهربان و بي‌نظيرم که هميشه چون کوه محکم کنارم هست
و
روان پاک مادرم که سال‌ها دعاي خيرش هميشه همراهم بود.
چکيده
پروتئين‌هاي شوک حرارتي (HSP) گروهي از پروتئين‌ها هستند که به علت ارتباط مستقيم با صفات مهم اقتصادي از قبيل مقاومت به تنش گرمايي و ورم پستان در پرورش گاو شيري داراي نقش قابل توجهي هستند. در اين پژوهش نمونههاي خون پس از تصحيح رکوردها در مدل آماري مربوطه و با توجه به توزيع عوامل باقي مانده از 200 راس گاو هلشتاين جمع‌آوري و استخراج DNA به روش نمکي بهينه يافته انجام شد. قطعاتي با طول 539، 275، 421 و 351 جفت باز به ترتيب از نواحي 5?UTR و 3?UTR ژن Hsp70.1، اگزون 3 تا 4 و اگزون 9 تا 10 ژن Hsp90AB1 با استفاده از PCR تکثير شدند. تعيين ژنوتيپ نمونه‌ها با روش PCR-SSCP انجام شد. در منطقه 5?UTR سه ژنوتيپ AA، BB و AB مشخص شد که فراواني ژنوتيپي آن‌ها به ترتيب در گروه 1 (با عوامل باقي‌مانده کمتر از ميانه) 42، 28 و 30 درصد و در گروه 2 (با عوامل باقي‌مانده بيشتر از ميانه) 46، 29 و 25 درصد همچنين در منطقه اگزون 3 تا 4 دو ژنوتيپ CD و CC مشخص شد که فراواني ژنوتيپي آن‌ها به ترتيب در گروه 1 برابر با 54 و 46 درصد و در گروه 2 برابر با 62 و 38 درصد محاسبه شد. همه نمونه ها در جايگاه 3?UTR ژن Hsp70.1 و اگزون 9 تا 10 ژن Hsp90AB1 يک شکل بوده و هيچ فرم آللي نمونههاي مورد بررسي مشاهده نشد. مطالعه ارتباطي نشانگر صفت در پژوهش حاضر ارتباط معني‌دار آماري را بين ژنوتيپ ها و صفات توليد شير، درصد چربي و درصد پروتئين شير نشان نداد.
کلمات کليدي: گاو هلشتاين، چندشکلي، PCR-SSCP، Hsp70.1، Hsp90AB1، صفات توليدي.
فهرست مطالبصفحهعنوانفصل اول- مقدمه11- مقدمهفصل دوم- کليات و بررسي منابع32- کليات 32-1- گاو هلشتاين42-2- صفات توليدي42-2-1- توليد شير روزانه52-2-2- چربي و پروتئين شير52-3- چاپرون62-4- کليات پروتئين شوک حرارتي (HSP)62-5- طبقه‌بندي HSP72-5-1- خانواده پروتئين شوک حرارتي 70 کيلو دالتوني (Hsp70)72-5-2- خانواده پروتئين شوک حرارتي 90 کيلو دالتوني (Hsp90)92-6- فعال شدن Hsp ها در پاسخ به شوک حرارتي102-7- Hsp70 و Hsp90 و سيستم ايمني112-8- نقش Hsp70 و Hsp90 در فيزيولوژي سلولي112-8-1- نقش در تنظيم شکل فضايي پروتئين‌ها112-8-2- هدف جديد داروي ضد تومور گلدانامايسين (Geldanamyscin)122-8-3- جابجايي گيرنده در سيتوپلاسم122-8-4- انتقال از منافذ هسته122-9- نقش Hsp70 و Hsp90 در تاخوردگي (Folding) پروتئين‌ها132-10- Hsp70 و Hsp90 و تنظيم آپوپتوزيس152-11- Hsp70 و Hsp90 و بيماري‌ها152-11-1- سرطان152-11-2- ديابت162-12- چند شکلي‌هاي Hsp70 و Hsp90فصل سوم- مواد و روش‌ها183-1- داده‌ها193-2- نمونه برداري 203-3- استخراج DNA203-3-1- بافرها و محلول‌هاي مورد استفاده در استخراج DNA213-3-2- مراحل استخراج DNA از نمونههاي خون223-3-3- ذخيره DNA223-3-4- تعيين ويژگي‌هاي کيفي DNA223-3-4-1- تعيين کميت وکيفيت DNA به وسيله الکتروفورز ژل آگارز233-3-4-2- تعيين کميت وکيفيت DNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتري233-4- واکنش زنجيره‌اي پلي مراز (PCR) 233-4-1- پروتکل و مواد مورد استفاده در PCR253-4-2- چرخه‌هاي حرارتي PCR263-5- الکتروفورز محصولات PCR روي ژل آگارز263-6- تعيين ژنوتيپ محصولات PCR ژن مورد نظرروي ژل پلي‌اکريل آميد263-6-1- تهيه ژل پلي‌اکريل‌آميد 273-6-2- محلول‌هاي مورد نياز براي رنگ آميزي ژل پلي‌اکريل‌آميد273-6-2-1- رنگ آميزي با نيترات نقره273-6-2-2- مراحل رنگ‌آميزي نيترات نقره273-6-2-2-1- محلول تثبيت کننده273-6-2-2-2- محلول رنگ‌آميزي283-6-2-2-3- محلول ظاهر سازي283-6-2-3- مراحل انجام کار293-7- تجزيه و تحليل داده‌ها293-7-1- برآورد فراواني‌هاي ژنوتيپي و آللي293-7-2- تجزيه و تحليل ارتباط ژنوتيپ با صفاتفصل چهارم- نتايج304-1- کميت و کيفيت DNA استخراج شده304-2- شناسايي چند شکلي در جايگاه‌هاي ژني مورد مطالعه با تکنيک SSCP304-2-1- شناسايي چند شکلي در جايگاه‌هاي ژن HSP70.1324-2-2- شناسايي چند شکلي در جايگاه‌هاي ژن HSP90AB1344-3- بررسي آماري344-3-1- فراواني ژنوتيپي و آللي 354-3-2- مقايسه فراواني‌هاي آللي 364-3-3- بررسي ارتباط بين ژنوتيپ و صفات توليديفصل پنجم- بحث و پيشنهادات375-1- ژن Hsp70.1385-2- ژن Hsp90AB1395-3- نتيجه گيري کلي405-4- پيشنهادات41منابع
فهرست جداول
صفحهعنوان4جدول 2-1- برخي از خصوصيات توليدي گاو هلشتاين7جدول 2-2- HSPهاي مهم در سلول پستانداران18جدول 3-1- اثر گذاري عوامل ثابت روي توليد روزانه20جدول 3-2- مواد تشکيل دهنده بافر جدا کننده20جدول 3-3- مواد تشکيل دهنده بافر ليز کننده22جدول 4-4- مواد محلول TBE(10X)24جدول 3-5- توالي آغازگرهاي استفاده شده در اين پژوهش25جدول 3-6- مواد لازم براي انجام واکنش زنجيره‌اي پلي مراز25جدول 3-7- درجه حرارت و زمان بهينه شده در مراحل مختلف واکنش PCR26جدول 3-8- مواد لازم براي تهيه ژل پلي‌اکريل‌آميد27جدول 3-9- مواد لازم براي تهيه محلول تثبيت کننده27جدول 3-10- مواد لازم براي تهيه محلول رنگ‌آميزي28جدول 3-11- مواد لازم براي تهيه محلول ظاهرسازي34جدول 4-1- فراواني آللي و ژنوتيپي در جايگاه 5?UTR ژن HSP70.1 در دو گروه35جدول 4-2- فراواني آللي و ژنوتيپي جايگاه اگزون 3 و 4 در ژن HSP90AB1 در دو گروه35جدول 4-3- مقايسه فراواني آللي و ژنوتيپي در دو گروه در جايگاه 5?UTR ژن Hsp70.135جدول 4-4- مقايسه فراواني هاي آللي و ژنوتيپي در دوگروه درجايگاه اگزون 3-4 ژن HSP90AB136جدول 4-5- ارتباط بين جايگاه 5?UTR ژن HSP70.1 و صفات توليدي36جدول 4-6- ارتباط بين جايگاه اگزون 3 و 4 ژن HSP90AB1 و صفات توليدي
فهرست شکل‌ها
صفحهعنوان1شکل 1-1- گاوداري صنعتي کشور بر حسب نوع فعاليت1شکل 1-2- مقدار توليد شير طي سال‌هاي 1368 الي 13919شکل 2-1- ساختمان Hsp70 و Hsp9013شکل 2-2- آپپتوزيس14شکل 2-3- فرآيند آپپتوزيس با حضور Hsp70 19شکل 3-1- توزيع عوامل باقي‌مانده صفت توليد روزانه در جمعيت پايه.30شکل 4-1- نمونه‌اي از DNA استخراج شده30شکل 4-2- محصولات PCR مربوط به جايگاه 5?UTR ژن HSP70.131شکل 4-3- محصولات PCR مربوط به جايگاه 3?UTR ژن HSP70.131شکل 4-4- نمونه‌اي از الکتروفورز محصولات PCR جايگاه 5?UTR ژن HSP70.1 توسط ژل پلي‌اکريل‌آميد 10%.32شکل 4-5- نمونه‌اي از الکتروفورز محصولات PCR جايگاه 3?UTR ژنHSP70.1 توسط ژل پلي‌اکريل‌آميد 10%32شکل 4-6- محصولات PCR مربوط به اگزون 3-4 ژن HSP90AB133شکل 4-7- محصولاتPCR مربوط به اگزون 9-10 ژن HSP90AB133شکل 4-8- نمونه‌اي از الکتروفورز محصولات PCR بين اگزون 3-4 از ژن HSP90AB1 توسط ژل پلي‌اکريل‌آميد 10%34شکل 4-9- نمونه‌اي از الکتروفورز محصولات PCR بين اگزون 9-10 از ژن HSP90AB1 توسط ژل پلي‌اکريل‌آميد 10%
فصل اول
مقدمه
1-1- مقدمه
جمعيت جهان در حال حاضر نزديک به 5/6 ميليارد نفر و با رشد 3/1 درصدي در حال افزايش است و برآورد شده که تا 50 سال آينده به دو برابر مي‌رسد. اين روند منجر به گسترش شهرها، روستاها و کاهش زمين‌هاي کشاورزي و مراتع شده و نياز به منابع غذايي افزايش مي‌يابد. سهم عمده توليد شير جهان متعلق به گاو مي‌باشد ولي گوسفند، گاوميش و بز نيز مقاديري از کل توليد شير را به خود اختصاص مي‌دهند. حدود 17 درصد کل گاوهاي موجود در جهان از نژادهاي اصلاح شده مي‌باشد. تعداد کل گاوهاي موجود در کشور بالغ بر 7 ميليون رأس مي‌باشدکه 7 درصد آن از گاوهاي اصلاح شده نژاد هلشتاين تشکيل مي‌دهد (مددخواه، 1389). درآمد صنعت پرورش گاو شيري به طور عمده از صفات توليدي است. به همين دليل اين صفات در اهداف اصلاح نژاد مورد توجه قرار گرفته‌اند. در سال هاي گذشته مقدار توليد شير در 305 روز معيار اصلي انتخاب در گاو شيري بوده است. با اين وجود، از عوامل اصلي سودآوري گاو توليد شير آن مي‌باشد (نافذ و همکاران، 1391).
براساس نتايج حاصل از طرح آمارگيري گاوداري‌هاي صنعتي کشور در سال 1392، تعداد کل گاوداري‌هاي صنعتي کشور 25353 واحد با ظرفيت 3264593 رأس است. از اين تعداد، 16295 گاوداري صنعتي با ظرفيت کل 2163750 رأس مربوط به فعاليت پرورش گاوشيري مي‌باشد (شکل 1-1). همچنين طبق آمار 878690 رأس گاو هلشتاين اصيل و 263872 رأس آميخته هلشتاين وجود دارد (شکل 1-1 و 2-1) (مرکز آمار ايران، 1392).
شکل 1-1- گاوداري صنعتي کشور بر حسب نوع فعاليت
شکل 1-2- مقدار توليد شير طي سال‌هاي 1368 الي 1391
تنش حرارتي، از جمله تنش‌هاي محيطي تاثير گذار بر عملکرد توليدي دام و طيور مي‌باشد. در اين ميان، گاوهاي شيري از دام‌هاي حساس نسبت به اين تنش بوده و در حال حاضر تنش حرارتي يکي از دغدغه‌هاي اصلي در امر پرورش گاو شيري در بسياري از مناطق گرمسيري و نيمه‌گرمسيري مي‌باشد (طاهري دزفولي، 1390).
به طور کلي، دماي محيط يکي از عوامل اصلي موثر بر عملکرد توليدي در گاو شيري مي‌باشد که منجر به انجام يکسري واکنش‌ها در سطح سلول و در کل بدن دام مي‌شود. اين واکنش‌ها به منظور جلوگيري از اختلالات فيزيولوژيک و سازش بيشتر دام با محيط اطرافش صورت مي‌گيرد. دام از طريق تنظيم دما به منظور ثابت نگه‌داشتن دماي بدن خود در دامنه محدود، واکنش‌هاي بيوشيميايي و فرآيندهاي فيزيولوژيک مرتبط با متابوليسم طبيعي بدن را کنترل مي‌نمايد. دماي مناسب و قابل تحمل گاوهاي شيري (دامنه حرارتي آسايش) بين 5 تا 25 درجه سانتي‌گراد گزارش شده است که در اين شرايط، دماي بدن گاو بين 1/39-4/38 درجه سانتي‌گراد مي‌باشد. در دماي بيش از 26 درجه سانتي‌گراد، گاو به مرحله‌اي مي‌رسد که به ميزان لازم نمي‌تواند گرما را از بدن دفع کند و در نتيجه در شرايط تنش حرارتي قرار مي‌گيرد (کادزر و همکاران، 2002).
طبق تحقيقات انجام شده ميزان توليد شير گاو هلشتاين در شرايط گرمسيري و نيمه گرمسير 40% تا 60% کمتر از شرايط معتدل مي‌باشد که اين امر نشان از تأثير عميق حرارت بر گاو هلشتاين مي‌باشد(وست و همکاران، 2003). لذا امروزه پرورش‌دهندگان گاو شيري، سعي مي‌کنند با تغييرات لازم در شرايط محيط پرورش و استفاده از انواع خنک کننده‌ها و يا تغيير در جيره غذايي، با اثر منفي تنش حرارتي مقابله نمايند. براي مثال شواهدي وجود دارد که نشان مي‌دهد تغذيه با عصاره قارچ آسپرژيلوس اوريزا (Aspergillusoryzae) مي‌تواند دماي بدن را در گاوهاي تحت تنش حرارتي کاهش دهد. اين مکانيسم تاکنون شناخته نشده است اما ممکن است اين کاهش حرارت، ناشي از اثرات کنترلي اين قارچ بر مراکز تنظيم دماي هيپوتالاموس باشد (هوبر و همکاران 1994؛ يو و همکاران، 1997).
روش‌هاي مديريتي، علي رغم اين‌که در بيشتر موارد نتيجه مثبت دارند، ولي اغلب منجر به افزايش هزينه پرورش مي‌شوند که در بسياري از موارد توجيه اقتصادي ندارند. بنابراين اگر گاوهاي مقاوم به گرما و يا ژن‌هاي مقاومت به گرما شناخته شوند، مي‌توان مقاومت به گرما را در گاوهاي شيري از نظر ژنتيکي بهبود بخشيد (کالير و همکاران، 2003؛ فينج و همکاران، 1886).
به همين منظور، بهبود سيستم توليد بايد به دنبال راهکارهايي از قبيل اصلاح نژاد، تغذيه و يا مديريت صحيح پرورش باشيم. در اين بين اصلاح نژاد که از تغيير ظرفيت ژنتيکي براي صفات اقتصادي مورد نظر انجام مي‌گيرد، از اهميت ويژه‌اي برخوردار است. هدف ازپژوهش حاضر شناسايي چند شکلي‌هاي موجود در ژن‌هاي HSP70.1 و HSP90AB1 و بررسي ارتباط آن‌ها با صفات توليدي در گاو هلشتاين بوده است.
فصل دوم
کليات و بررسي منابع
2- کليات
در زمينه اصلاح نژاد دام آن مطلبي که هميشه اهميت داشته و مورد بررسي قرار گرفته است، مسأله انتخاب حيوانات بوده است. صفات مختلف يک حيوان را مي‌توان از نظر تعداد ژن‌هاي کنترل کننده و ميزان تأثير عوامل محيطي به دو دسته صفات کيفي و صفات کمي تقسيم کرد. صفات کيفي توسط يک يا تعداد کمي ژن کنترل و بيان مي‌شود و عوامل محيطي در بروز اين صفات تأثير چنداني ندارد. ولي صفات کمي اغلب توسط تعداد زيادي ژن کنترل مي‌شوند و در بروز آن‌ها عوامل محيطي مؤثر هستند. اغلب صفات کيفي وراثت پذيري بالايي دارند، در نتيجه انتخاب و اصلاح اين صفات نسبتاٌ آسان است و غالباٌ نيازي به انتخاب غير مستقيم وجود ندارند. ولي صفات کمي که عوامل محيطي بر آن‌ها مؤثر است، فنوتيپ موجود ممکن است گوياي ژنوتيپ صفات نباشند، براي رفع اين مشکل تکنيک‌هاي پيشرفته اصلاح نژاد با استفاده از علم آمار تدوين شده است. اين روش‌ها در چندين سال اخير بسيار مفيد بوده و پيشرفت‌هاي قابل توجهي را موجب شده‌اند. امروزه تکنولوژي ژنتيک مولکولي انقلابي در تجزيه ژنتيکي گونه‌هاي اهلي ايجاد کرده است. به طوري که بر اساس آن مي‌توان چند شکلي را در سطح DNA شناسايي و از آن به عنوان نشانگرهاي مولکولي استفاده کرد و به مطالعه افراد در موجودات مختلف پرداخت (فصيحي هرندي و همکاران، 1377؛ نجاتي جوارمي، 1378).
اخيرأ مطالعات در زمينه مکانيسم ژنتيکي و مولکولي مقاومت تنش حرارتي، با استفاده از روش‌هاي نوين ژنتيکي مورد توجه قرار گرفته است. روش‌هاي جديد به پژوهشگران اين امکان را مي‌دهد که شرايط ويژه توليدي، فيزيولوژيک و سلامتي دام را در سطح ژن بررسي و مشخص نمايند (اسپور و همکاران 2007).
2-1- گاو هلشتاين
طبق نظريه کان فان يک نژاد از يک حيوان به گروه بزرگي از حيوانات داخل يک گونه اطلاق مي‌شود که داراي منشأ مشترکي هستند و مي‌توان صفات خاص نژادي را در آن‌ها با يک دامنه تغييرات محدود مشاهده نمود و قادرند اين ويژگي‌ها را با تغييرات محدودي به فرزندانشان انتقال دهند. معمولاٌ اين ويژگي‌هاي نژادي مربوط به صفات توليدي و مورفولوژيکي آن‌ها مي‌باشد. البته اين کار بسيار مشکلي است که تعاريف کاملا مشخص و دقيقي از صفات کمي براي معرفي يک نژاد داشته باشيم، چون اين ويژگي‌ها به صورت ثابت نيستند. بنابراين مي‌توان صفات کمي يک نژاد را با ميانگين مشخص نمود، اگر چه دامنه تغييرات افراد از ميانگين زياد است.در گاوداري‌هاي صنعتي کشور اغلب اقدام به پرورش و نگه‌داري گاوهاي شيري نژاد هلشتاين مي‌نمايند. عملکرد صفات توليد شير در اين نژاد در جدول 1-2 ارائه شده است (دادار، 1375؛ قرباني و خسروري،1390).
جدول 2-1- برخي از خصوصيات توليدي گاو هلشتاين
مشخصاتمقاديرتوليد شير روزانه (کيلوگرم)25-30توليد شير در يک دوره شيردهي (کيلوگرم)5700-4800درصد چربي5/3-65/3درصد پروتئين17/3-22/3
2-2- صفات توليدي
پرورش گاو شيري يکي از بخش‌هاي مهم صنعت دامپروري است و براي پرورش‌دهندگان گاو شيري، توليد شير منابع اصلي درآمد بوده و از مهم‌ترين صفات در شاخص انتخاب محسوب مي‌شوند. از آن‌جا که هدف اصلي از برنامه‌هاي اصلاح نژاد در گاوهاي شيري، افزايش توليد، بهره‌وري سيستم‌هاي توليدي، انتخاب و دست‌يابي به پيشرفت ژنتيکي است، محققين اصلاح نژاد دام اطلاعاتي را مورد توجه قرار مي‌دهند که بتوانند ارزش ژنتيکي دام را به خوبي نشان دهند. در طي دهه‌هاي اخير با پيشرفت علم ژنتيک موفقيت‌هاي زيادي در زمينه اصلاح نژاد دام‌ها و در نتيجه افزايش توليدات دامي به دست آمده است. صفات توليدي در گاوهاي شيري (مقدار شير، درصد چربي و پروتئين) جزء صفات کمي بوده که تعداد زيادي ژن مسئول کنترل آن‌ها مي‌باشند و با توجه به وراثت‌پذيري متوسط، امکان رکورد برداري دقيق وآسان و ارزش اقتصادي بالا، مورد توجه متخصصان اصلاح نژاد قرار گرفته است (قاضي خاني شاد و همکاران، 1390).
لازم است بدانيم تغييراتي که در طي ساليان متمادي در عملکرد توليدي رخ داده است يا رخ نداده است مي‌توان در صورت وجود واريانس اين مسئله را علت‌يابي کرد. اين تغييرات مي‌تواند ناشي از عوامل ژنتيکي و محيطي اعم از تأثير اقليم، مديريت، اندازه گله و ساير عوامل که برخي نامشخص و عده‌اي شناخته شده‌اند، باشد (آصفي، 1392).
2-2-1- توليد شير روزانه
از ميان صفات حائز اهميت در عملکرد اقتصادي گاوهاي شيري، صفات توليدي (نظير توليد شير) در انتخاب گاوهاي شيري جهت افزايش ارزش اصلاحي و سود اقتصادي داراي اهميت ويژه‌اي مي‌باشند که علاوه بر عوامل ژنتيکي، تحت تأثير عوامل محيطي نيز مي‌باشد. علي رغم وجود جمعيت قابل توجه گاو شيري در کشورهاي در حال توسعه، ميزان توليد شير به ازاي هر رأس گاو پايين بوده که مي‌توان آن را با عواملي نظير دوره‌هاي شيردهي، فصل زايش و سال زايش مرتبط دانست. تفاوت مقدار توليد در گله‌هاي مختلف و يا در بين گاوهاي يک گله تحت تأثير عواملي است که مانع از شناخت دقيق ارزش اصلاحي حيوانات مي‌گردد. لذا بايد اين عوامل و ميزان تأثير آن‌ها را قبل از برآورد ارزش اصلاحي حيوانات تعيين و سپس رکوردها را براي آن‌ها تصحيح نمود (روشن و همکاران، 1391).
در مطالعات انجام شده در گاو هلشتاين ايران توارث‌پذيري صفت توليد شير در محدوده‌ي 20/0-32/0 تخمين زده شده است. دامنه روند ژنتيکي و فنوتيپي توليد شير 305 روز در مطالعات مختلف به ترتيب 99/10- تا 78/249 و 23/44 تا 85/271 کيلوگرم در سال مي‌باشد (نافذ و همکاران، 1391).
توارث‌پذيري توليد شير در يک دوره‌ي شيردهي بسيار متفاوت گزارش شده است و از حداقل 12/0 تا حداکثر 47/0 گزارش شده است. از طرفي همبستگي صفت توليد شير روزانه با توليد در يک دوره‌ي شيردهي با توجه به گزارش کامرون (1997) بسيار بالا گزارش شده است که در اين صورت به منظور انتخاب افراد برتر مي‌توان از رکوردهاي شير روزانه استفاده کرد (استرادلئون و همکاران، 2008؛ حسين‌پور مشهدي و همکاران، 2008).
2-2-2- چربي و پروتئين شير
در مطالعات انجام شده روي گاو هلشتاين ايران توارث‌پذيري صفت چربي شير در محدوده 34/0-23/0 تخمين زده شده است و روند ژنتيکي چربي شير در محدوده 46/3-06/0 کيلوگرم در سال گرازش شده است (نافذ وهمکاران، 1391).
رضوي و همکاران (1386) در مطالعات خود روي گاو هلشتاين استان مرکزي وراثت‌پذيري چربي و درصد چربي شير را به ترتيب 03/0±23/0 و 02/0±32/0 برآورد کردند. همچنين تکرار پذيري چربي و درصد چربي شير را به ترتيب 39/0 و 4/0 اعلام کردند. روند فنوتيپي مقدار و درصد چربي را به ترتيب 23/0 کيلوگرم و 5/0 درصد، و روند ژنتيکي آن را 06/0 کيلوگرم و 02/0- درصد و روند محيطي آن‌ها را به ترتيب 21/0 کيلوگرم و 07/0 تخمين زده‌اند.
در تحقيقات انجام شده در جمعيت گاوهاي هلشتاين مناطق مختلف توسط محققين در داخل و خارج کشور وراثت‌پذيري مقدار چربي و درصد چربي به ترتيب در محدوده 23/0 تا 37/0 و 14/0 تا 32/0 گزارش شده است. همچنين مقادير روند ژنتيکي براي مقدار چربي 46/3 کيلوگرم گزارش شده است (رضوي وهمکاران 1386).
2-3- چاپرون
پروتئين‌هايي که تا شدن پروتئين‌هاي ديگر را تسهيل مي‌کنند چاپرون (Chaperone) ناميده مي‌شوند. اين واژه اولين بار توسط ران لاسکي و همکاران مطرح شد. آن‌ها اين واژه را براي يک نوع پروتيئن (نوکليوپلاسمين) که براي تجمع هيستون‌ها و DNA لازم بود به کار بردند. نوکليوپلاسمين به هيستون‌ها متصل مي‌شوند و به تجمع آن‌ها براي تشکيل نوکلئوزوم بدون اين‌که خود وارد ساختار بشوند، کمک مي‌کنند. بنابراين چاپرون‌ها کاتاليست‌هايي هستند که بدون اين‌که خود وارد ساختار شوند باعث تسهيل در شکل گيري پروتئين‌ها مي‌شوند. آن‌ها به قسمتي از پروتيئن تاخورده متصل شده و باعث ثبات آن ناحيه مي‌شوند که اين ثبات باعث هدايت پلي‌پپتيد به تا خوردن صحيح سه بعدي مي‌شود. فقدان چاپرون سبب تا نخوردن صحيح و يا عدم ثبات پلي‌پپتيد خواهد بود که اين عدم تاخوردگي و بي‌ثباتي سبب ايجاد کمپلکس‌هاي نامحلول مي‌شود. همچنين ثبات پلي‌پپتيدهاي تانخورده هنگام عملکرد اندامک‌هاي درون سلولي نقش مهمي دارند.، که نمونه‌ي بارز آن را در انتقال پروتئين‌ها از سيتوزول به داخل ميتوکندري مي‌توان ديد. بسياري از چاپرون‌ها به عنوان يک پروتئين شوک حرارتي (Heat shock protein) شناخته شده‌اند (پنرتو، 2002؛ ها و همکاران، 2009؛ گوپتا وهمکاران، 2010).
2-4- کليات پروتئين شوک حرارتي (HSP)
براي نخستين بار در سال 1962 دانشمندي به نام ريتوسا واکنش سلول نسبت به شوک حرارتي در کرموزوم‌هاي بزاقي مگس سرکه (Drosophila melanogaster) گزارش شد. کرموزوم‌ها بعد از قرار گرفتن در معرض حرارت، حالت متورمي را نشان دادند (ررول و همکاران، 2011). 12 سال بعد محصولات ژني مسئول اين فرآيند شناسايي شده و پروتيئن شوک حرارتي (HSP: Heat Shock Protein) نام گرفت (تايساير و همکاران، 1974).
پروتئين‌هاي شوک حرارتي به عنوان پروتئين‌هاي بسيار حفاظت شده هستند که تحت شرايط شوک گرمايي القا مي‌گردند. بعداٌ مشخص شد که اين پروتئين‌ها توسط استرس‌هاي ديگر مثل پرتو فرابنفش، استرس اکسيداتيو، مواد شيميايي، ايکسمي، تغييرات ميزان گلوکز، ايجاد آنالوگ گلوکز و اسيدهاي آمينه، حضور يون‌هاي مختلف، اتانول، فلزات مختلف، داروها، هورمون‌ها، عفونت باکتريايي و ويروسي نيز فعال مي‌گردند. اين پروتئين‌ها از جد پروکاريوتي مشتق شده‌اند (ماير و بوکان، 2005: ويتلي و همکاران، 1999).
2-5- طبقه‌بندي HSP
پروتئين‌هاي شوک حرارتي يا Hsp هاي پستانداران بر مبناي اندازه و وزن مولکولي‌شان به دو گروه تقسيم شده‌اند: Hsp هاي با وزن مولکولي بالا و Hsp هاي کوچک يا sHsp. اولين گروه شامل سه خانواده مهم است Hsp90، Hsp70 و Hsp60. بعضي از آن‌ها به طور خودبه‌خودي بيان مي‌شوند در حالي که القاي بقيه تحت شرايط استرس ايجاد مي‌گردد. Hsp هاي با وزن مولکولي بالا چاپرون‌هاي وابسته به ATP (آدنوزين تري فسفات) مي‌باشند و به کوچاپرون‌ها براي تنظيم شکل فضايي و اتصال به ATP نياز دارند.Hsp هاي کوچک شامل Hsp20، Hsp27 و ?،? کريستالين است.sHspها چاپرون‌هاي مستقل از ATP هستند. عملکرد و جايگاه سلولي Hspها بر اساس وزن مولکولي در جدول 2-2 ذکر شده است. (کريستين و همکاران، 2004؛ ماسلي، 1997).
جدول 2-2- HSPهاي مهم در سلول پستانداران
وزن مولکولي (KD)عملکردجايگيري سلولي28-27پايداري ميکروفيلامنت‌ها و انتقال پيام سيتوکنينسيتوزول و هسته60اجتماع پروتئينميتوکندري73-70جابجايي و پيچش پروتئينسيتوزول، هسته و شبکه اندوپلاسمي، ميتوکندري90جابجايي پروتئين، تنظيم گيرندهسيتوزول، هسته، شبکه اندوپلاسمي104-100پيچش پروتئينسيتوزول
2-5-1- خانواده پروتئين شوک حرارتي 70 کيلو دالتوني (Hsp70)
خانواده Hsp70 حاوي ايزوفرم‌هاي 66 تا 78 کيلو دالتوني است که به صورت Hsp70 نشان داده مي‌شود و ژن کد کننده آن Hsp70 است (موريموتو، 1993) و غالباٌ کد کننده اسيدآمينه متيونين در آغاز زنجيره و اسيدآمينه آسپارتيک در انتهاي زنجيره مي‌باشد (مسعودي و همکاران، 1390). نيمه عمر Hsp70القا شده با افزايش دما در سلول‌ها يپستان‌داران تحت شرايط آزمايشگاهي حدود 48 ساعت است (مايزن و ولچ، 1988).
در زمان فقدان استرس پروتئين‌هاي Hsp70 حدود 1% کل پروتئين‌هاي سلولي و در زمان بروز استرس حدود 20% کل پروتئين‌ها را شامل مي‌شود (ولش 1992). ژن‌هاي اين خانواده در سراسر ژنوم پراکنده شده و روي کرموزوم‌هاي متعددي قرار گرفته‌اند و اين خانواده‌هاي ژني از توالي‌هاي تک اگزوني و يا به عبارتي فاقد اينترون تا توالي‌هايي داراي 18 اگزون تشکيل شده‌اند. توالي‌هاي تک اگزوني معمولا در بيشتر گونه‌هاي حيواني ديده مي‌شود (مسعودي و همکاران، 1390). Hsp70.1 در گاو روي کروموزوم شماره 23 قرار دارد و داراي 1 اگزون است (گالگر و همکاران، 1993).
2-5-2- خانواده پروتئين شوک حرارتي 90 کيلو دالتوني(Hsp90)
Hsp90 در سيتوزول، هسته و شبکه رتيکولوم آندوپلاسمي يافت مي‌شود. در انسان و بسياري از پستانداران اين پروتئين در بسياري از عضلات از جمله عضلات صاف نيز وجود دارد. اين پروتئين بيش از 2% از کل پروتئين‌هاي سلول را شامل مي‌شود. اين پروتئين به صورت دايمر عمل مي‌کند، يعني قسمتي از هتروکمپلکس را فراهم يا گردآوري مي‌کند. Hsp90 در انتها داراي مکان اتصال بوده و فعاليت Atpase پاييني دارد. اين پروتئين مي‌تواند به فيلامنت‌هاي فعال در شرايط مختلف متصل شود. فعاليت Hsp90 بسيار وابسته به غلظت کاتيون‌هاي دو ظرفيتي است. اين خانواده شامل Hsp هايي با اوزان مختلف 82، 83 و 89 کيلو دالتون مي‌باشد. اين پروتئين در موجودات مختلف داراي همولوژي بالايي است. مثلاٌ در پستانداران حدود 60% با مخمرها و 78% با پروتئين Hsp90 درزوفيلا همولوژي دارد. هرچند مقدار Hsp90 در هنگام شوک حرارتي افزايش مي‌يابد ولي Hsp90 يک چاپرون مهم در عملکرد پروتئين‌هاي سيگنالي مي‌باشد و همچنين در کنفورماسيون صحيح گيرنده‌هاي هورموني نظير هورمون‌هاي استروئيدي نقش مهمي دارد. اين پروتئين به گيرنده‌يهورمون استروئيدي متصل شده و از ميان کنش آن با DNA هسته‌اي تا زمان اتصال هورمون جلوگيري مي‌کند. پروتئين تنظيم کننده گلوکز (Grp94) همولوگ Hsp90 مي‌باشد که در يوکاريوت‌ها وجود دارد. اين پروتئين‌ها با ساير چاپرون‌ها در تاخوردگي و عملکرد صحيح پروتئين‌ها همکاري مي‌کند. مثلا با چاپرون Hsp70، Hsp23 و Hsp50 ارتباط مستقيم دارد. اين مجموعه چاپرون‌ها کمپلکس مولتي چاپرون (Multi-Chaperone complex) نام دارد. غير فعال شدن Hsp90 در اين کمپلکس منجر به تجزيه شدن سريع ساير چاپرون‌ها مي‌شود. در ضمن غير فعال شدن Hsp90 در عملکرد بسياري از پروتئين کينازهاي وابسته به آن نظير Raf-1، ErbB-2 و Bcr-Ab1 وقفه و اختلال ايجاد مي‌کند. داروهايي نظير گلدانامايسين (Geldanamycin)، هربي مايسين (Herbimycin A) و بسياري از آنتي بيوتيک‌هاي ضد قارچي با Hsp90 باند شده و عملکرد آن را مختل مي‌کنند.
Hsp90 از نظر ساختماني داراي سه پايانه است. 1- انتهاي متصل شونده به نوکلئوتيد که ناحيه N ترمينال را تشکيل مي‌دهد. اين ناحيه به بازدارنده‌هاي Hsp90 متصل مي‌شود، همچنين ممکن است به پپتيدها نيز متصل گردد. 2- يک بخش مياني که با پروتئين Client واکنش مي‌کنند. 3- ناحيه C ترمينال که در هموديمريزاسيون شرکت مي‌کنند. بررسي توالي ژنوم Hsp90 نشان مي‌دهد که دو ناحيه حفاظت شده در اعضاي خانواده Hsp90 وجود دارد (شکل 2-1). ساختمان پايانه N ترمينال مي‌تواند در حضور ATP يا ADP کريستاليزه شود. ولي همه نوکلئوتيد دچار تغييرات ساختماني مشخصي نمي‌گردند. نوکلئوتيد در کمپلکس Hsp90/ADP داراي يک ساختمان بسيار فشرده است. انتهاي N ترمينال Hsp90 داراي اسيد آمينه حفاظت شده مي‌باشد و عملکرد شبيه به فعاليت ATPase دارند. سوبسترايي که به ناحيه N ترمينال اين چاپرون متصل مي‌شوند از نظر شکل فضايي نبايد تا خورده باشند و پروتئين‌ها يا پلي‌پپتيدهايي با 30-13 اسيدآمينه مي‌باشند. مولکول‌هايي که قسمتي از آن تانخورده توسط اين چاپرون حفاظت نمي‌گردد. مطالعات در مورد Hsp90 نشان مي‌دهد که اين چاپرون در تاخوردگي پروتئين تحت شرايط فيزيولوژيکي و در شرايط شوک گرمايي شرکت مي‌کند. در اين شرايط Hsp90 به ATP نياز ندارد. اين نتايج بيان مي‌دارد که Hsp90 داراي 2 مکان چاپروني مستقل است. مکان N ترمينال چاپرون به ATP متصل مي‌شود در حالي که مکان C ترمينال چاپرون مستقل از ATP مي‌باشد. برخلاف ناحيه N ترمينال اين چاپرون، پروتئين‌هايي که کاملا تانخورده و يا قسمتي از آن تاخورده و پپتيدها با طول متغيير مي‌توانند به ناحيه C ترمينال Hsp90 متصل گردند. تاخوردگي پروتئين بدون نياز به ATP از ناحيه C ترمينال اين پروتئين انجام مي‌گيرد. در حد واسط دو ناحيه بسيار حفاظت شده ساختمان ابتدايي Hsp90 مکاني با شارژ بالا وجود دارد که بين اعضا خانواده‌يHsp90 همولوژي کمي دارد و طول آن متفاوت است. در ناحيه C ترمينال پنتاپپتيد MEEVD وجود دارد که در بين اکثر خانواده Hsp90 حفاظت شده است (شکل 2-1) (ارلجمن و همکاران، 2014؛ طاهريان وهمکاران 2008).
شکل 2-1- ساختمان Hsp70 و Hsp90
2-6- فعال شدن Hspها در پاسخ به شوک حرارتي
سازش سلولي به شوک گرمايي مکانيسم بسيار پيچيده‌اي است. چگونگي پاسخ سلول به شوک حرارتي که سلول را وادار به تحريک بقا سلول مي‌کند يا درگير آپوپتوزيس مي‌گردد به توالي ژن و مقاومت نسبت به گرما بستگي دارد. به طور کلي شوک حرارتي القا توسط سنتز رونويسي DNA، پردازش mRNA، فرآيند ترجمه و پيشرفت سيکل سلولي را متوقف مي‌نمايد. افزايش دناتوراسيون پروتئين و تجمع نادرست آن باعث افزايش تجزيه پروتئوزمي و ليزوزومي مي‌شود. شوک حرارتي باعث تخريب ترکيبات سيتو اسکلتون و تغييرات در نفوذپذيري غشا مي‌گردد. در سازش سلول به شوک گرمايي، سلول‌ها بيان ژن‌ها را تغيير داده که باعث تحمل سلول به گرما مي‌گردد. ژن‌هاي بي‌شماري به وسيله شوک حرارتي افزايش بيان يا کاهش بيان مي‌يابند. اين تغييرات در بيان ژن در مدت کوتاهي پس از شوک حرارتي القا مي‌گردد. گروه عمده پروتيئن‌هايي که با اين مکانيسم بيان مي‌شوند، پروتئين‌هاي شوک حرارتي (Hsp) هستند که به عنوان چاپرون عمل مي‌کنند. القاء بيان Hsp توسط گرما به وسيله توالي پروموتر ويژه، عناصر شوک گرمايي (HSE) انجام مي‌گيرد. چندين کپي سکانس پنتاپپتيد 5?NGAAN-3? درون پروموتور ژن‌هاي Hsp وجود دارد. پاسخ گرمايي اين پروموترها با فعاليت فاکتورهاي شوک گرمايي (HSF) تنظيم مي‌گردد. 3 نوع HSF در سلول‌هاي پستانداران وجود دارد شامل: HSF-1، HSF-2 و HSF-3. که در بين آن‌ها HSF-1 يک ترکيب کليدي مهم است و در تنظيم بيان ژن توسط گرما نقش مهمي دارد در حالي که فعاليت HSF-2 و HSF-3 مستقيماٌ مربوط به تنظيم پاسخ گرمايي بيان ژن نمي‌باشد. در سلول‌هايي که تحت تأثير درجه حرارت بالا نبوده‌اند، HSF-1 به صورت مونومر در سيتوپلاسم سلول مستقر مي‌باشد و به Hsp ها (مثل Hsp70 و Hsp90) متصل مي‌شوند. در حين فعال شدن توسط گرما HSF-1 از Hsp ها رها شده و وارد هسته مي‌شود. در اين حالت HSF-1 به صورت مونومر غيرفسفريله مي‌باشد. پس از ورود به هسته مونومرهاي HSF-1 تريمره شده و در اسيدآمينه سرين فسفريله مي‌گردد. فسفريلاسيون HSF-1 يک مرحله مهم و ضروري است که در اتصال به DNA نقش دارد و براي القاء رونويسي از ژن‌ها لازم است. فسفريلاسيون HSF-1 توسط چندين پروتئين کيناز انجام مي‌شود. اين کينازها يا فعاليت رونويسي HSF-1 را فعال مي‌کنند و يا مي‌توانند اين فاکتورها را متوقف کنند. پاسخ به شوک حرارتي مشابه ساير مسيرهاي Signaling است. فسفريلاسيون اسيدآمينه سرين ser203، ser307، ser419 باعث تنظيم منفي HSF-1 است. HSF-1 به 5 مکان اتصال براي فعال شدن رونويسي نياز دارد. به علاوه چندين HSE درون پروموتور قابليت القا گرما براي رونويسي ژن را بالا مي‌برد. HSF-1 باعث فعال شدن سريع رونويسي ژن مي‌گردد. که چند ساعت پس از افزايش دما طول مي‌کشد. افزايش بيان Hsp باعث ارتباط مجدد با HSF-1 شده و موجب پايان پاسخ شوک گرمايي در سلول‌ها در يک فيدبک منفي مي‌شود. مکانيسم سلولي HSF-1 با واسطه پاسخ شوک حرارتي HSF-1 به صورت مونومر درون سيتوپلاسم سلواهايي که حرارت نديده است وجود دارد. در سيتوپلاسم HSF-1 هيپوفسفريله هستند و به چاپرون‌هايي مثل Hsp90، Hsp70 متصل مي‌باشند. اين چاپرون‌ها از اتصال HSF-1 به DNA جلوگيري مي‌کنند. مرحله مهم پاسخ حرارتي به صورت زير است:
1- شوک گرمايي باعث جدايي Hsp از HSF-1 مي‌شوند.
2- HSF-1 به هسته منتقل مي‌شوند، در هسته HSF-1 تريمريزه شده و به صورت هموتريمر و در مکان سرين به وسيله HSF کينازهاي ويژه فسفريله مي‌گردند و به تواليHSE در پروموتر ژن‌هاي پاسخ گرمايي مثل Hsp70 متصل مي‌گردند.
3- فعال شدن رونويسي به وسيله HSF-1 بيان Hsp را افزايش مي‌دهد و باعث ورود مجدد Hsp70 به هسته مي‌شود.
4- Hsp70 هسته‌اي دوباره در ارتباط با HSF-1 تريمر قرار مي‌گيرد. HSF-1 تريمر به شکل مونومر غير فعال جدا مي‌شود. هموتريمر HSF-1 به توالي ويژه HSE متصل مي‌شود. براي اتصال بهينهHSF-1، 5 مکان اتصال وجود دارد. مکان اتصال براي HSF-1 با واسطه پاسخ حرارتي ضروري است. براي فعال شدن پاسخ گرمايي، چندين سکانس HSE در پروموتر ژن‌هاي قابل القاء حرارتي وجود دارد. اين شرايط مي‌تواند در پروموتر Hsp70 مشاهده شود (پرس و ليندکايست، 1993؛ موريموت و همکاران، 1997؛ ويتلي و همکاران، 1999).
2-7- Hsp70 و Hsp90 و سيستم ايمني
پروتئين‌هاي شوک حرارتي در سيستم ايمني نقش مهمي دارند چرا که مولکول‌هايي که در تشخيص آنتي‌ژن دخالت مي‌کنند مانند ايمينوگلوبين‌ها، گيرنده‌هاي سلول T همه به وسيله‌ي چاپرون‌ها پيش برده مي‌شود. پاتوژن‌ها براي حفاظت خود در مقابل ميزبان از مکانيسم‌هاي مختلف استفاده مي‌کند، از جمله افزايش سنتز پروتئين‌هاي شوک حرارتي است که براي زنده ماندن پاتوژن‌ها در بدن ميزبان به وسيله تجربياتي از جمله، موتاسيون در پاتوژن روشن شده است. پروتئين‌هاي شوک حرارتي در پردازش و عرضه‌ي آنتي‌ژن نقش مهمي دارند. تشکيل کمپلکس پايداري که قادر به عرضه پپتيدهاي آنتي‌ژن به سلول T هستند بستگي به تاخوردگي صحيح و تجمع آن‌ها در رتيکولوم آندوپلاسميک دارد. پروتئين‌هاي شوک حرارتي ظاهراٌ به عنوان آنتي‌ژن‌هايي مهم در دفاع در مقابل عوامل عفوني به کار مي‌روند و به دليل حفظت بالايشان در ميان پاتوژن‌هاي ميکروبي، پروتئين‌هاي شوک حرارتي آنتي‌ژن‌هاي مهم هستند. آن‌ها به عنوان القا کننده‌هاي بسيار قوي پاسخ ايمني هومورال و سلولي در عفونت‌هاي متعدد شناخته شده‌اند. Hsp70 جلوي مرگ و مير سلول‌هايي را که در معرض حمله TNF (فاکتورهاي نکروز دهنده‌ي توموري) هستند را مي‌گيرد و مانع توليد مقدار زياد اينترکولين 6 مي‌شود. همچنين Hsp70 از آپوپتوزيس ناشي از شوک حرارتي در سلول‌ها جلوگيري مي‌کند و در کرم‌ها، پروتوزوئرها، قارچ‌ها و باکتري‌ها به عنوان هدف‌هاي آنتي‌بادي شناخته شده‌اند. قابل ذکر است که برخي از اعضاي خانواده Hsp نظير Hsp70 و Hsp90 مي‌توانند سلول‌هاي مربوط به سيستم ذاتي را تحريک کنند. (مطيعي و همکاران، 1390).
2-8- نقش Hsp70 و Hsp90 در فيزيولوژي سلولي
2-8-1-نقش در تنظيم شکل فضايي پروتئين‌ها
اولين عملکرد سلولي Hsp90 در يوکاريوت‌هاي عالي به اين گونه است که در فقدان هورمون، به گيرنده‌هاي هورمون‌هاي استروئيدي متصل مي‌شوند. اين کمپلکس‌ها پايدار هستند. هورمون‌هاي استروئيدي باعث جدايي کمپلکس و ديمريزاسيون گيرنده مي‌شوند که براي اتصال DNA و فعال شدن رونويسي نياز است. اتصال با Hsp90 به عنوان يک حد واسط در تاخوردگي محسوب مي‌گردد. کمپلکس سوپر چاپرون Hsp90 شامل چندين ترکيب چاپروني است که قادر است مستقيماٌ با پروتئين‌هاي غير طبيعي واکنش کند. در نتيجه Hsp90 مي‌تواند با مکانيسم ويژه همراه با فاکتورها تاخوردن پروتئين‌هاي هدف را حمايت نمايد (صالح‌پور و همکاران، 1389).
2-8-2-هدف جديد داروي ضد تومور گلدانامايسين (Geldanamyscin)
اخيراٌ Hsp90 به عنوان هدف جديد داروهاي ضد تومور در نظر گرفته مي‌شود. ترکيبات طبيعي مواد بازدارنده تکثير سلول‌هاي تومور، بنزوکينون آنسامايسين GA مي‌باشد که از استرپتومايسين هيگروسکوپيک به دست آمده است. GA بازدارنده چرخه کينازهاي سلولي است.GA موجب جدايي سريع Hsp90-raf-1 و در نهايت موجب از بين رفتن پروتئين raf-1 کيناز مي‌شود. ولي سنتز raf-1 افزايش مي‌يابد و از سيتوزول به غشاء پلاسمايي منتقل مي‌شود براي اين‌که raf-1 پايدار بماند بايد به Hsp90 اتصال يابد تا در سلول به طور مناسب مستقر گردد. احتمالاٌGA بازدارنده عملکرد ويژه Hsp90 مي‌باشد. اين ايراد با تحقيقات ديگري تأييد و نشان داده شد که GA به طور کامل عملکرد Hsp90 را غيرفعال نمي‌کند بلکه در مرحله خاصي چرخه ديناميک پروتئين‌هاي سوبسترا را متوقف نمايد. GA به مکان اتصال ATP در Hsp90 متصل مي‌شود و ساختمان N ترمينال Hsp90 را براي اتصال به پروتئين‌ها را تغيير مي‌دهد و ناحيه C ترمينال تحت تأثير دارو قرار نمي‌گيرد. مقايسه ساختمان پايانه N ترمينال Hsp90 در حضور GA يا ATP نشان مي‌دهد که GAمشابهADP/ATP است. تقريباٌ همه واکنش‌هاي هيدروفوبيک بين GA و Hsp90 به صورت واکنش‌هاي اکي‌والان مي‌باشد. ويژگي اتصال GA به Hsp90 نشان مي‌دهد که GA به Hsp70 متصل نمي‌شود (فروتن جهرمي، 2012).
2-8-3- جابجايي گيرنده در سيتوپلاسم
رسپتور گلوکوکوتيکوئيد (GR) يک مدل مناسب براي حرکت فاکتور رونويسي از سيتوپلاسم به هسته مي‌باشد. زيرا اين فاکتورها به طور طبيعي در سيتوپلاسم سلول‌هاي فاقد هورمون وجود دارد و حرکت آن به هسته وابسته به هورمون است. به‌طور کلي گيرنده‌هاي استروئيدي بين سيتوپلاسم و هسته در حال حرکت مي‌باشند. با تغيير شکل ليگاند کمپلکس Hsp90.GR تغييراتي براي تجمع در هسته ايجاد مي‌شود. در ابتدا تصور مي‌شد تغيير شکل وابسته به ليگاند GR باعث رهايي Hsp90 مي‌شود که براي حرکت به هسته، گيرنده را ترک مي‌کند ولي اخيراٌ مشخص شده است که GR به همراه Hsp90 منتقل مي‌شود (شرملي و همکاران، 1998).
2-8-4- انتقال از منافذ هسته
وقتي کمپلکس به غشاي هسته مي‌رسد پروتئين‌هاي علامت دهنده (signaling) آن‌ها را از منافذ هسته عبور مي‌دهد که عبور انتخابي گيرنده‌ها به داخل يا خارج Importin و Exportin ناميده مي‌شود. براي برخي ترکيبات 2 پروتئين Importin وجود دارد که در ورود اين ترکيبات به داخل هسته دخالت مي‌کند. علاوه بر Importin ها و Exportin ها، چاپرون Hsp70 نقش مهمي در عبور ترکيبات از منافذ هسته دارند. Hsp70 در شناسايي NLS دخالت دارد ولي چگونگي آن مشخص نيست (ردي و تيوآري، 2011).
2-9- نقش Hsp70 و Hsp90 در تاخوردگي (Folding) پروتئين‌ها
اگر چه جزئيات سه بعدي چند صد پروتئين شناخته شده است، ولي مسيري که اين پلي‌پپتيدها به شکل فضايي نهايي خود مي‌رسند مشخص نشده است. مطالعات در مورد تاخوردگي مجدد (Refolding) ريبونوکلئاز در شرايط آزمايشگاهي اطلاعات لازم براي تعيين شکل فضايي نهايي پروتئين را فراهم نمود. پروتئين‌هاي دناتوره شده مي‌توانند مجدداٌ تاخورده و به شکل فضايي طبيعي برسد. تاخوردگي مجدد در شرايط آزمايشگاهي ممکن است با واکنش زير انجام گيرد.
1- تخريب نواحي هيدروفوبيک به مولکول داخلي.
2- تشکيل ساختمان ثانويه که شرايط را براي تاخوردگي بعدي فراهم مي‌کند.
3- ايجاد واکنش‌هاي کووالانت، مثل اتصالات دي‌سولفيد، که باعث پايداري پلي‌پپتيدها به شکل فضايي مي‌گردد.
در تاخوردگي مجدد پروتئين در شرايط آزمايشگاهي عدم تاخوردگي پلي‌پپتيدها به ندرت رخ مي‌دهد مگر اين‌که در مدت سنتز در درجه حرارت‌هاي بالا باشد. در نهايت پلي‌پپتيدهايي که قسمتي از آن‌ها تانخورده به همراه پروتئين‌هاي ويژه‌اي، مخصوصاٌ پروتئين‌هاي شوک حرارتي تشکيل کمپلکس داده و موجب تاخوردگي نهايي پروتئين مي‌شود. از مهم‌ترين خانوادهHSP ي که در اين عمل نقش اساسي دارد مي‌توان به Hsp70 اشاره نمود. Hsp70 و پروتئين‌هاي همراه آن مي‌توانند پلي‌پپتيدهاي تازه سنتز شده را پايدار کرده تا بخش‌هاي مختلف زنجيره براي تاخوردگي در دسترس قرار گيرد (بوکان و همکاران، 1998؛ مانده و همکاران 1989).
2-10- Hsp70 و Hsp90 و تنظيم آپوپتوزيس
آسيب‌هاي وارده به سلول مي‌تواند دو نوع پاسخ متفاوت ايجاد کند.
1- آپوپتوز: که حالتي از مرگ سلولي است که سلول‌هاي آسيب ديده را حذف مي‌کند تا از ايجاد التهاب جلوگيري نمايد.
2- شوک گرمايي يا پاسخ به استرس: که از آسيب جلوگيري مي‌کند و يا باعث بهبودي سلول آسيب ديده و در نتيجه باعث بقاء حيات سلول مي‌گردد.
برهم کنش‌هاي بين اين دو مسير تعيين مي‌کند که يک سلول در شرايط استرس‌هاي بيولوژيک چه پاسخي از خود نشان مي‌دهد. آپوپتوزيس يک مسير مرگ برنامه ريزي شده سلول است. آپوپتوزيس توسط خانواده‌اي از پروتئازها تحت عنوان کاسپازها (عامل فعال شدن) انجام مي‌شود. مولکول محرک ديگر در آپوپتوزيس Apaf-1 (فاکتور فعال کننده آپوپتوزيس) است و از ديگر تنظيم کنندگان آپوپتوزيس خانواده BCL-2 مي‌باشد که شامل مولکول‌هاي پيش آپوپتيک Bax، Bad، Bak، Bid مي‌باشد (شکل 2-2).
شکل 2-2- آپپتوزيس
از مهم‌ترين Hspها در آپپتوزيس Hsp70 و Hsp90 مي‌باشند. فعاليت‌هاي چاپروني Hspها با چرخه واکنش‌هاي اتصال به ATP، هيدروليز و تعويض نوکلئوتيد تنظيم مي‌شود. در اثر اين واکنش‌ها مجموعه‌اي از چرخه‌هاي اتصال و جدا شدن بين Hspها و پلي‌پپتيدهاي هدف ايجاد مي‌شود. در حالتي که Hsp به
قیمت: تومان